Biotechnological conversion of lignocellulose hydrolyzates : model microorganisms for a bio-based economy

Abstract

Lignocellulose has substantial potential as a carbon source in a bio-based economy. It is the most abundant renewable raw material on earth and is available in large quantities as waste from the agriculture, food and wood industry. It is composed mainly of the polymers lignin, cellulose and hemicellulose. In contrast to glucose derived from cellulose, hemicellulose sugars often remain unused although 60 billion tons of hemicelluloses are produced annually. Hemicelluloses are a group of heterogeneous polysaccharides consisting of different monomers such as D xylose, D arabinose, D mannose and D galactose. Lignocellulose is mostly depolymerized in order to obtain fermentable sugars. During the depolymerization process, inhibitors such as organic acids or furan aldehydes can be formed or released, which could be problematical for biotechnological processes. The aim of this thesis was to develop and evaluate bacterial-based biotechnological processes capable of using hemicellulose sugars as a source of carbon. First, Pseudomonas putida KT2440 was chosen. Pseudomonades are claimed as a promising chassis in biotechnology due to their versatile and robust metabolism. Unlike other Pseudomonades, the strain KT2440 is classified as biosafety level 1 in the American Type Culture Collection (ATCC). However, these bacteria can metabolize glucose as the only lignocellulose monosaccharide. Cellvibrio japonicus was the second selected bacterium. This strain is not yet established as a microbial host in biotechnology, but can degrade a huge portfolio of plant cell wall polysaccharides and is also classified as biosafety level 1 in ATCC. The topic of the first publication was to engineer P. putida KT2440 strains for metabolizing the hemicellulose monosaccharides xylose and arabinose and characterize their growth behavior. Initially, an arabinose metabolizing strain with the araBAD operon and a xylose metabolizing strain with xylAB operon was constructed. Later on, these strains were cultivated in minimal salt medium with glucose, xylose and arabinose as carbon sources in Erlenmeyer flasks. The recombinant P. putida KT2440 strains metabolized xylose and arabinose with high growth rates comparable to glucose. It turned out that both engineered strains were able to grow on both pentoses as well as on mixtures of glucose xylose and arabinose. The intent of the second publication was to evaluate P. putida KT2440 as a platform model organism for bioconversion of lignocellulose hydrolyzates. Strains were cultivated in minimal salt medium with several hydrolyzates as carbon source in Erlenmeyer flask and bioreactor. In addition, the growth-inhibiting effect of major toxic substances contained in lignocellulose hydrolyzates on P. putida KT2440 was analyzed via cultivation experiments. Several suitable hydrolyzates were figured out for this strain. Formic acid and acetic acid proved to be relatively unproblematic under pH neutral conditions, whereas furfural and hydroxymethylfurfural (HMF) had a negative effect on the bacterial growth. A diauxic-like growth behavior was revealed via fed batch bioreactor cultivations, since pentoses were almost not consumed with sufficient glucose supply. Consequently, feed-medium was added step-by-step in the next experiment. The applied feed profile did lead to an almost complete metabolization of xylose. The purpose of the third publication was to evaluate C. japonicus as a potential host strain for the one‐step bioconversion of xylans into rhamnolipids. Cultivation experiments were performed in Erlenmeyer flasks filled with minimal salt medium and containing different carbon sources. Furthermore, the strain was transformed with the plasmid pSynPro8oT carrying rhlA (encodes acetyltransferase) and rhlB (encodes rhamnosyltransferase I) to complete the rhamnolipid metabolism. The strain grew on all main lignocellulose monosaccharides as well as, on different xylans. Mono rhamnolipids were produced with the engineered strain using xylans as carbon source. This is particularly interesting as most industrially relevant bacteria are not able to depolymerize wood polymers. As the product yields were quite low, there are still many challenges in order to achieve an economically efficient process. Nevertheless, to the best of our knowledge, it is the first published one step bioconversion of hemicellulose polymers into rhamnolipids. In total, P. putida KT2440 turned out as a flexible and powerful model organism and two xylose and arabinose metabolizing strains were constructed. Moreover, bioreactor cultivations with lignocellulose hydrolyzates were performed and a feeding strategy to overcome diauxic-like growth behavior was presented. A proof of concept for a one-step bioconversion of xylans into rhamnolipids with a recombinant C. japonicus strain was successfully demonstrated.

Im Rahmen einer biobasierten Wirtschaft wird Lignocellulose als Kohlenstoffquelle ein großes Potential zugesprochen. Sie ist der am häufigsten vorkommende nachwachsende Rohstoff auf unserer Erde und steht in großen Mengen als Abfallstoff aus der Agrar-, Lebensmittel- und Holzindustrie zur Verfügung. Lignocellulose besteht hauptsächlich aus den Polymeren Lignin, Cellulose und Hemicellulose. Im Gegensatz zu der aus der Cellulose stammenden Glucose werden die Hemicellulose-Zucker selten als Kohlenstoffquelle in biotechnologischen Prozessen verwendet, obwohl jährlich ca. 60 Milliarden Tonnen Hemicellulosen anfallen. Hemicellulosen sind eine Gruppe von heterogenen Polysacchariden, welche hauptsächlich aus den Monosacchariden D Xylose, L Arabinose, D Mannose D Glucose und D Galactose zusammengesetzt sind. Um fermentierbare Zucker aus der Lignocellulose zu erhalten, muss diese meist depolymerisiert werden. Bei diesem Verzuckerungsprozess können für biotechnologische Prozesse problematische Stoffe wie z.B. organische Säuren oder Furanaldehyde gebildet oder freisetzet werden. Ziel dieser Arbeit war es, bakteriell basierte biotechnologische Prozesse zu entwickeln und zu bewerten, die Hemicellulose-Zucker als Kohlenstoffquelle nutzen können. Zum einen wurde der Bakterienstamm Pseudomonas putida KT2440 ausgewählt. Pseudomonaden gelten aufgrund ihres vielseitigen und robusten Stoffwechsels als vielversprechende Biokatalysatoren. Im Gegensatz zu vielen anderen Pseudomonaden ist der Stamm KT2440 in der ATCC (American Type Culture Collection) unter der Risikogruppe 1 eingeordnet. Allerdings können Pseudomonaden außer Glucose keine weiteren Lignocellulose-Zucker als Kohlenstoffquelle nutzen. Als zweiter Bakterienstamm wurde Cellvibrio japonicus ausgewählt. Dieser Stamm ist als Wirt für biotechnologische Prozesse nicht etabliert, ist aber in der Lage, ein großes Portfolio an Pflanzenzellwand Polysacchariden abzubauen und ist der Risikogruppe 1 zugeordnet. Das Thema der ersten Publikation war die Konstruktion von Xylose- und Arabinose-verstoffwechselnden P. putida KT2440-Stämmen und die anschließende Charakterisierung ihres Wachstumsverhaltens. Zunächst wurde jeweils ein Stamm zur Metabolisierung von Xylose und Arabinose konstruiert. Hierzu wurde das xylAB-Operon und das araBAD-Operon von Escherichia coli verwendet. Zur Analyse des Wachstumsverhaltens wurden die Stämme daraufhin in Minimalmedium und mit Glucose, Xylose und Arabinose als Kohlenstoffquelle in Erlenmeyerkolben kultiviert. Die rekombinanten P. putida KT2440 Stämme wuchsen mit Xylose und Arabinose mit ähnlich hohen Wachstumsraten wie mit Glucose. Zudem konnten beide Stämme die jeweils andere Pentose verstoffwechseln und es konnten Kultivierungen mit Mischungen aus Glucose, Xylose und Arabinose erfolgreich durchgeführt werden. Ziel der zweiten Publikation war es, das Potenzial von P. putida KT2440 als Biokatalysator für die Biokonversation von Lignocellulose-Hydrolysaten zu bewerten. Die Stämme wurden in Minimalmedium mit verschiedenen Hydrolysaten als Kohlenstoffquelle in Erlenmeyerkolben und im Bioreaktor kultiviert. Darüber hinaus wurde mittels Kultivierungsversuchen die wachstumshemmende Wirkung von in Lignocellulose-Hydrolysaten enthaltenen toxischen Substanzen auf P. putida KT2440 untersucht. Es konnten mehrere geeignete Hydrolysate für diesen Stamm ausgemacht werden. Ameisensäure und Essigsäure erwiesen sich als relativ unproblematisch unter pH-neutralen Bedingungen, wohingegen Furfural und Hydroxymethylfurfural (HMF) schon bei niedrigen Konzentrationen einen negativen Effekt auf das Wachstum von P. putida KT2440 hatten. Mittels eines Fed Batch Prozesses im Bioreaktor mit Lignocellulose-Hydrolysaten wurde ein diauxi ähnliches Wachstumsverhalten nachgewiesen. Bei ausreichend verfügbarer Glucose wurde die Xylose kaum verstoffwechselt. Als mögliche Strategie zur Lösung dieses Problems wurde der Feed stufenweise dazugegeben. Dies führte zu einer nahezu vollständigen Verstoffwechselung von Xylose. Im Rahmen der dritten Veröffentlichung wurde ein Prozess zur einstufigen Biokonversion von Hemicellulose-Polymeren zu Rhamnolipiden mit dem Bakterium C. japonicus als Wirtstamm getestet. C. japonicus wurde in Minimalmedium zusammen mit verschiedenen Kohlenstoffquellen in Erlenmeyerkolben kultiviert. Um den Rhamnolipidstoffwechsel zu vervollständigen, wurde der Stamm mit dem Plasmid pSynPro8oT mit rhlA (kodiert Acetyltransferase) und rhlB (kodiert Rhamnosyltransferase I) transformiert. C. japonicus wuchs auf allen wichtigen Lignocellulose-Monosacchariden sowie auf verschiedenen Xylanen. Mit dem rekombinanten Stamm und Xylan als Kohlenstoffquelle konnte Mono-Rhamnolipid hergestellt werden. Dies ist insbesondere interessant, da die meisten industriell relevanten Bakterien nicht in der Lage sind, Holzpolymere zu depolymerisieren und zu verstoffwechseln. Jedoch erwies sich die Transformation als schwierig und es konnten nur niedrige Produktausbeuten erzielt werden. Aufgrund dessen sind noch viele Herausforderungen zu bewältigen, um einen wirtschaftlich rentablen Prozess zu erhalten. Nichtsdestotrotz handelt es sich nach unserem Wissen um die erste einstufige Biokonversation von Hemicellulose-Polymeren zu Rhamnolipiden. Zusammenfassend, erwies sich P. putida KT2440 als flexibler und leistungsfähiger Wirtsorganismus. Xylose und Arabinose metaboliserende Stämme wurden konstruiert und Prozessstrategien für Bioreaktor Kultivierungen wurden entwickelt. Des Weiteren konnte ein Proof of Concept für eine einstufige Biokonversion von Xylanen zu Rhamnolipiden mit einem transformierten C. japonicus Stamm erfolgreich erbracht werde