Utilizing process waters from conversion processes based on regenerative resources for microbial production of platform chemicals

Abstract

A future bioeconomy relying on biotechnological production processes makes it necessary to find a replacement for sugars as microbial carbon source to prevent ethically questionable competition with the food and feed sector. An attractive alternative is acetic acid, as it is inexpensive, available in high quantities and utilized equally well as glucose by some bacteria. Still, the application of acetic acid as sole carbon source in bioproduction processes offers several challenges. In its protonated form acetic acid leads to medium acidification, when applied in high concentrations, while as salt it leads to salinization causing osmotic stress for the production organisms. As such, established process strategies are difficult to apply with acetic acid, making specialized strategies necessary for production processes. Therefore, an efficient fed-batch strategy was developed and is presented in the 1st publication utilizing acetic acid as sole carbon source for production of itaconic acid with a genetically modified strain C. glutamicum ICDR453C (pEKEx2-malEcadopt). An earlier published pH-coupled feeding strategy for addition of glacial acetic acid was adapted to obtain the nitrogen limited conditions necessary for itaconic acid production. It was found that the consumption of ammonia at high carbon to nitrogen ratios of the feeds, which was necessary to achieve nitrogen limited conditions, caused acidification of the medium. This countered the increase of pH-value caused by acetic acid consumption and led to early acetate depletion. Thus, an additional DO-coupled feeding of sodium acetate was started once acetic acid in the medium was depleted. Sodium acetate did not directly effect the pH-value, but its consumption again led to an increase of the pH-value and continuation of the pH-coupled feeding. With this combined strategy an itaconic acid production process was developed with separate growth and production phases. In the end a titer of 29.2 g/L and a volumetric productivity of 0.63 g L−1h−1 were achieved. These were comparable to bacterial production processes using glucose as sole carbon source, with the only drawback being a lower yield. Still, the results demonstrated that C. glutamicum is suited as production organism on acetate as alternative carbon source. Another challenge is, that biobased acetic acid, for example produced by thermochemical conversion of lignocellulose, is often available only in dilute concentrations up to 50 g/L or in complex solutions containing potentially harmful substances. Therefore, conventional fed-batch processes are not applicable, because of strong dilution of the product and accumulation of inhibitors. Perfusion bioreactors can be a solution to these problems. They allow application of dilute substrate concentrations, as the bacteria are retained in the reactor. Furthermore, the continuous flow through the system prevents accumulation of inhibitors. Thus, the 2nd publication presented a newly developed, lab scale perfusion bioreactor, that was manufactured via 3D-printing using the fused filament fabrication method. Hydrophilic flat sheet membranes in the main bioreactor module were used for cell retention. A circulation flow was applied for diffusive oxygen supply via an oxygen transfer module that contained hydrophobic membranes and for temperature control via a heat exchanger module. The bioreactor system was characterized regarding oxygen transfer rates and mixing time. Finally, a proof-of-concept cultivation with C. glutamicum ATCC13032 on glucose utilizing a dilute feed solution resulted in 18.4 g/L biomass after 53 h of cultivation and a maximum specific growth rate of 0.34 1/h. Until the end of the process no membrane blockage occurred. This showed that the reactor system was suited for bacterial cultivation as well as for application of dilute substrates. To sum it up, it was shown that acetic acid can be efficiently used as alternative carbon source for bioproduction with C. glutamicum as model organism. Still, in case of itaconic acid production further genetic modifications are necessary in future works to increase the product yield. Regarding process strategies for utilization of biobased acetic acid in dilute solutions, a new 3D-printed perfusion bioreactor was successfully developed, and its function proven. Future works can focus on the application of the perfusion system for production processes and evaluate its suitability for bioprocesses with sustainably produced acetic acid

F¨ur eine zukünftige Bioökonomie, die sich auf biotechnologische Prozesse für die Herstellung von Produkten verlässt, ist es notwendig einen Ersatz für Zucker als mikrobielle Kohlenstoffquelle zu finden, um eine ethisch fragwürdige Konkurrenz zu Lebens- und Futtermittel zu vermeiden. Essigsäure ist dabei eine attraktive Alternative, da sie günstig ist, in großen Mengen verfügbar und bei manchen Bakterien ähnlich gut verstoffwechselt wird, wie Glucose. Dennoch bietet die Anwendung von Essigsäure als einzige Kohlenstoffquelle einige Herausforderungenin für Bioprozesse. In ihrer protonierten Form führt Essigsäure zur Versauerung des Mediums. Als Salz führt sie aufgrund der Zufuhr des nicht-verstoffwechselten Co-Ions zu einer Versalzung, die osmotischen Stress bei den Bakterien auslöst. Dadurch lassen sich konventionelle Prozessstrategien nur schwer anwenden. Stattdessen müssen spezialisierte Prozessführungsstrategien f¨ur Essigsäure entwickelt werden. Deswegen war das Ziel der ersten Publikation, einen Fed-Batch Prozess zu entwickeln, mit dem eine effiziente Umwandlung von Essigsäure durch den genetisch modifizierten Stamm C. glutamicum ICDR453C (pEKEx2-malEcadopt) zu Itakonsäure erreicht werden konnte. Mit diesem Stamm war eine Limitierung an Stickstoff für die Produktion von Itakonsäure notwendig, weshalb ein bereits veröffentlichter pH-gekoppelter Fed-Batch Prozess an diese Bedingung angepasst wurde. Dabei trat das Problem auf, dass bei hohen Kohlenstoff- zu Stickstoffverhältnissen der Feeds, wie sie zum Erreichen der Stickstofflimitierung notwendig waren, der Verbrauch von Ammoniak durch die Bakterien zu einer Versauerung des Mediums führte. Diese wirkte dem pH-Anstieg durch den Verbrauch von Essigsäure entgegen und resultierte in einen frühen Essigsäuremangel. Als Lösung wurde der Prozess um eine zusätzliche an den pO2 gekoppelte Zufütterungsstrategie für Natriumacetat erweitert. Natriumacetat beeinflusst bei der Zugabe den pH-Wert nicht direkt. Stattdessen führt erst der erneute Verbrauch von Acetat zu einem pH-Anstieg und zu einer Fortsetzung der pH-gekoppelten Zufütterung von Essigsäure. Mit dieser kombinierten Zufütterungsstrategie konnte ein Prozess für die Itakonsäureproduktion entwickelt werden, bei dem Biomassezunahme und Itakonsäureproduktion zeitlich getrennt werden konnten. Es wurden ein Titer von 29.2 g/L und eine volumetrische Produktivität von 0.63 g L−1h−1 erreicht. Diese waren vergleichbar mit bakteriellen Produktionsprozessen mit Glucose als Kohlenstoffquelle, wobei der einzige Nachteil ein geringerer Ertrag war. Die Ergebnisse belegten, dass C. glutamicum ein geeigneter Modellorganismus für die Produktion mit Essigsäure als einziger Kohlenstoffquelle ist.

Eine weitere Herausforderung ist die Verfügbarkeit von biobasierter Essigsäure zumeist in Lösungen mit geringen Konzentrationen oder in komplexen Lösungen mit potenziell schädlichen Komponenten. Die geringe Konzentration führt bei konventionellen Fed-Batch Prozessen zu einer starken Verdünnung des Produkts sowie zu einer Akkumulation von Inhibitoren, weshalb sie nicht geeignet sind. Eine mögliche Lösung bieten Perfusionsbioreaktoren. Diese erlauben die Verwendung von geringen Substratkonzentrationen, da die Zellen im Reaktor zurückgehalten werden und bei erhöhten Flussraten nicht ausgeschwemmt werden. Zudem vermeidet der kontinuierlich Feed-Strom die Akkumulation der Inhibitoren. Deswegen wurde in der zweiten Veröffentlichung ein Perfusionsbioreaktor entwickelt, der mittels des additiven Herstellungsverfahrens fused filament fabrication hergestellt wurde. Hierbei wurden hydrophile Membranscheiben im Hauptbioreaktormodul für die Zellrückhaltung eingesetzt. Ein Kreislaufstrom wurde für die diffusive Sauerstoffversorgung mittels hydrophober Membranen in einem Sauerstoff-Transfer Modul sowie für die Temperaturkontrolle mit einem Wärmetauscher-Modul angelegt. Das Bioreaktorsystem wurde anhand der Sauerstofftransferrate sowie anhand der Mischzeit charakterisiert. Zuletzt wurde eine Kultivierung von C. glutamicum ATCC13032 mit Glucose sowie unter Verwendung einer niedrigkonzentrierten Feedlösung als Proof-of-Concept durchgeführt. Diese resultierte in eine maximale Biomassekonzentration von 18.4 g/L nach 53 h und einer maximalen spezifischen Wachstumsrate von 0.34 1/h. Bis zum Ende des Prozesses trat keine Blockade der Membran ein. Damit wurde gezeigt, dass sich das Reaktorsystem für die Kultivierung von Bakterien sowie für die Anwendung dünner Substrate eignet.

Zusammengefasst wurde gezeigt, dass Essigsäure effizient als alternative Kohlenstoffquelle für die mikrobielle Produktion mit C. glutamicum als Modellorganismus eingesetzt werden kann. Dennoch sind für die Produktion von Itakonsäure weitere genetische Anpassungen nötig, um den Ertrag zu erhöhen. Für die Biokonversion von biobasierter, niedrigkonzentrierter Essigsäure wurde erfolgreich ein 3D-gedruckter Perfusionsbioreaktor entwickelt und seine Funktion bewiesen. Zukünftige Arbeiten können sich auf die Anwendung des Perfusionssystems für Produktionsprozesse fokussieren und dessen Eignung für Bioprozesse zum Beispiel mit Lignocellulose-basierter Essigsäure evaluieren