Neuronale Modulation : der Einfluss von Agonisten und inverser Agonisten auf das Cannabinoidsystem einer hippocampalen Primärkultur

Abstract

The aim of this thesis was to investigate the effect of inverse agonists on the CB1-receptor with an established complex neuronal-/ glia- co culture obtained from hippocampi of embryonic rats. To provide evidence of the expression of the CB1-receptors in the established culture immunocytochemical studies have been used and showed a sufficient expression level of the CB1-receptors. The neuronal culture was further tested on various electrophysiological parameters to verify an in vitro assay that resembles in vivo characteristics. Thus the exposure of TTX to neurons lead to reduced spike activity which refers to the blocking of voltage gated sodium channels. Also the inhibition of AMPA receptors using CNQX showed a reduction of spike activity in respect of the reduced synaptic activity. Analyses of the kinetic and spike frequencies of the generated actionpotentials as well as the kinetics and frequencies of spontaneous AMPA- and NMDA epscs are to a large extent comparable to published data of in vitro and in vivo assays. To reduce the intrinsic variability of the established cannabinoid assay the method of induced burst activity under low magnesium conditions has been used. This method results indeed in a lower variability of the assay but also the analysis of the effect of cannabinoid agonists and inverse agonists on the evoked burst activity showed interesting inverse modulations of burst durations, event intervals and inter-event intervals compared to alterations of the spike frequencies. On the basis of the obtained data by the analyzed spike-frequencies an agonistic effect of nanomolar concentrations of the investigated inverse agonists could be shown for the first time. This observation could lead to the conclusion that this might be a specific interaction of the investigated inverse agonist with an other receptor. The inhibition of the adenylatcyclase, a key-enzyme of the CB1 signal transduction, neutralizes the agonistic effect, although the inverse agonistic effect dissapeard. In addition the interaction of the opioid system in respect to the observed agonistic effect of rimonabant has been investigated. However, non of the published interaction of this two systems in respect to the agonistic effect of rimonabant could be observed.

Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkung von inversen Agonisten des CB1-Rezeptors anhand einer primären hippocampalen Neuronen-/Gliazellen- Kokultur zu untersuchen. Immuncytochemisch konnte gezeigt werden, dass in den kultivierten Neuronen die CB1-Rezeptoren in nachweisbaren Mengen exprimiert werden. Die aus Rattenembryonen erstellte Primärkultur wurde weiterhin auf elektrophysiologische Parameter untersucht um eine in vivo nahe in vitro Kultur zu gewährleisten. So reagieren die Neuronen auf TTX mit verminderter Spikeaktivität die auf die Blockierung der spannungsabhängigen Natriumkanäle zurückzuführen ist. Auch die Inhibition von AMPA Rezeptoren unter Verwendung von CNQX zeigte eine Reduktion der Spikefrequenz auf synaptischer Ebene. Analysen der Kinetik und der Frequenz der generierten Aktionspotentiale, sowie der AMPA- und NMDA EPSCs sind mit bereits publizierten in vitro und in vivo Daten weitgehend vergleichbar. Um die intrinsische Variabilität des verwendeten Assays zu verringern, wurde der für die pharmakologischen Untersuchungen des Cannabinoidsystems eingesetzte Messpuffer mit einer geringen Konzentration Magnesium versehen, um den NMDA-Rezeptorblock aufzuheben. Die daraus resultierenden Aktionspotential-Bursts sorgten einerseits für eine geringere Variabilität der Messungen, andererseits konnte durch erweiterte Analysen dieser Bursts die Auswirkungen der eingesetzten CB1-Agonisten und inversen CB1-Agonisten auf das Burstverhalten der gemessenen Neuronen ermittelt werden. Hierbei zeigte sich ein gegensätzliches Verhalten von Aktionspotentialfrequenz zur Modulation der generierten Aktionspotentiale pro Burst, Pausen zwischen den Bursts und Länge der Bursts. Auf der Basis der durch die Aktionspotential-Frequenzanalysen gewonnenen Daten konnte erstmals eine agonistische Komponente bei nanomolaren Dosen der inversen Agonisten gezeigt werden, was auf eine spezifische Interaktion mit einem beteiligten oder noch nicht bekannten Rezeptor hindeutet. Die Blockierung der Adenylatzyklase, eines Schlüsselenzyms in der Signaltransduktion des CB1-Rezeptors, hebt diesen Effekt auf, allerdings ist auch kein invers agonistischer Effekt mehr messbar. Des weiteren wurde auf eine Beteiligung des Opioidsystems an der agonistischen Wirkung des inversen Agonisten Rimonabant untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte keine der publizierten Wechselwirkungen dieser beiden Systeme im Bezug auf den agonistischen Effekt von Rimonabant beobachtet werden.