Adaptations of maize to low phosphate availability : establishing regulatory networks from large-scale quantitative proteomic profiling

Abstract

Maize (Zea mays) is an important crop in global for human food, animal feed and industrial usage. Suboptimal phosphorus (P) availability is one of the primary constraints for maize growth and productivity (Jianbo Shen et al., 2011; L.pez-Arredondo et al., 2014). Over 70% arable land suffers from P-deficiency, and plants can take up small amounts of P from the soil due to P-fixation. However, over-application of P fertilizer has frequently happened in last decades and resulted in environmental pollution (L.pez- Arredondo et al., 2014). Modern agriculture calls for maintaining productivity while reducing synthetic-P fertilizer inputs and losses, thus, requiring breeding of novel cultivars to increase phosphate use efficiency (PUE) (Balemi and Negisho, 2012; X., Li, Mang, et al., 2021; Mardamootoo et al., 2021). Understanding the regulation of maize to low phosphate(LP)-availability at the molecular level will offer unlimited potential for the development of selection markers and engineering targets in breeding programs. Nowadays, “OMIC” approaches and computational science are developing rapidly. They are advanced tools for investigation of molecular adaptations on a large-scale and in a systemic view. Thereby, the major research task within this thesis is to reveal P-deficiency induced responsive components and regulations at protein level based on proteomic profiles, aiming to provide promising candidate genes/proteins for research on the molecular mechanisms of adaptation to LP-stress, and potentially to provide promising candidate gene/proteins for development of selection markers and engineering targets to obtain desired traits, in the long term goal of improving PUE in novel cultivars. In Chapter 1, we focused on six genotypes (EP1, F2, F142, F160, SF1, SM1) with close genetic background but several contrasting traits to LP-stress, such as PUE (X., Li, Mang, et al., 2021). They were cultured in pot with either sufficient or inefficient P-fertilizer in a climate chamber for one month. The young seedlings were sampled by root and shoot for analysis of multiple traits, transcriptome and proteome. Firstly, we constructed the co-expression network of proteins and transcripts separately using WGCNA method (Langfelder and Horvath, 2008), which predicted potential protein-protein interactions or their co-regulations. Secondly, we categorized proteins/transcripts to modules according to their different coexpression patterns, thus, identified potential determining relationships of modules-traits. Thirdly, we compared the responses between transcripts and proteins, presenting their responses being concordant or dis-concordant. Fourthly, we identified common and genotype-specific P-starvation response modules and biological processes. Finally, we focused on protein kinases, which play roles as regulators, to demonstrated protein kinases-centered network and validated protein interactions between mitogenactivated protein kinase-kinase 1 (MEK1, Zm00001d043609) either with sucrose synthase1 (SH1,Zm00001d045042) or translation elongation factor 1-gamma 3 (eEF1B-γ, Zm00001d046352). MEK1 is a potential genotype-specific regulator via sucrose metabolism and translation elongation process. In Chapter 2, we aimed to adapted an experimental workflow for phosphoproteome analysis in maize, addressing the interference to phosphoproteome quantification by fibers, secondary metabolites and low abundant of phosphorylated proteins. In this manuscript, we described a rapid and universal protocol for both proteome and phosphoproteome analysis that is suitable for cereal crops. The results of phosphoproteome in maize root testing samples showed that proteins within kinase-centered network in Chapter 1 can be largely quantified based on this workflow. It provides a possible way to analyze phosphorylation dynamics to P-starvation responses, it allows further investigation for kinase-centered 1 network in Chapter 1 to identify phosphorylation pairs of “protein kinase – protein substrate”, which will largely expand a view on P-starvation regulations through posttranslational modifications.

Mais (Zea mays) ist weltweit eine wichtige Kulturpflanze für die menschliche Ern.hrung, Tierfutter und industrielle Nutzung. Die suboptimale Verfügbarkeit von Phosphor (P) ist eines der wichtigsten Hemmnisse für das Wachstum und die Produktivit.t von Mais (Jianbo Shen et al., 2011; L.pez-Arredondo et al., 2014). Mehr als 70 % der Ackerfl.chen leiden unter P-Mangel, und die Pflanzen k.nnen aufgrund der Immobilit.t von P-Verbindungen nur geringe Mengen an P aus dem Boden aufnehmen. Dennoch hat eine überm..ige Ausbringung von P-Dünger in den letzten Jahren h.ufig zu einer Umweltverschmutzung geführt (L.pez-Arredondo et al., 2014). Die moderne Landwirtschaft verlangt die Aufrechterhaltung der Produktivit.t bei gleichzeitiger Verringerung des Einsatzes synthetischer P-Dünger und der Verluste, was die Züchtung neuer Sorten zur Steigerung der Phosphatverwendungseffizienz (PUE) erfordert (Balemi und Negisho, 2012; X., Li, Mang, et al., 2021; Mardamootoo et al., 2021; Mi et al., 2021). Das Verst.ndnis der Regulierung von Mais auf niedrige Phosphat(LP)-Verfügbarkeit auf molekularer Ebene bietet ein unbegrenztes Potenzial für die Entwicklung von Selektionsmarkern und technischen Zielen in Zuchtprogrammen. Die molekularen Reaktionen und Regulationsmechanismen in Antwort auf niedrige PVersorgung bei Mais sind jedoch noch weitgehend unerforscht. Heutzutage sind "OMIC"-Ans.tze und computergestützte Wissenschaften fortschrittliche Werkzeuge für die Untersuchung molekularer Anpassungen in gro.em Ma.stab und mit systematischem Blick. Die Hauptforschungsaufgabe im Rahmen dieser Arbeit besteht darin, die durch P-Mangel induzierten Reaktionskomponenten und -regulationen auf Proteinebene anhand von Proteomikprofilen aufzudecken, um vielversprechende Kandidatengene/- proteine für die Erforschung der molekularen Mechanismen der Anpassung an LP-Stress bereitzustellen und potenziell vielversprechende Kandidatengene/-proteine für die Entwicklung von Selektionsmarkern und technischen Zielen zur Erzielung der gewünschten Eigenschaften zu liefern, mit dem langfristigen Ziel, den PUE-Wert in neuen Sorten zu verbessern. In Kapitel 1 konzentrierten wir uns auf sechs Genotypen (EP1, F2, F142, F160, SF1, SM1) mit .hnlichem genetischen Hintergrund, aber mehreren kontrastierenden Merkmalen gegenüber LP-Stress, wie z. B. PUE (X., Li, Mang, et al., 2021). Sie wurden einen Monat lang in T.pfen mit ausreichendem oder ineffizientem P-Dünger in einer Klimakammer kultiviert. Die Wurzeln und Sprosse junger S.mlinge wurden für die Analyse mehrerer Merkmale, des Transkriptoms und des Proteoms entnommen. Zun.chst rekonstruierten wir das Koexpressionsnetzwerk von Proteinen und Transkripten separat mit der WGCNAMethode (Langfelder und Horvath, 2008), die potenzielle Protein-Protein-Interaktionen oder deren Ko- Regulationen vorhersagte. Zweitens kategorisierten wir Proteine/Transkripte nach ihren unterschiedlichen Koexpressionsmustern in entsprechende Module und identifizierten so potenziell bestimmende Beziehungen zwischen Modulen und Merkmalen. Drittens haben wir die Reaktionen zwischen Transkripten und Proteinen verglichen und ihre Reaktionen als abh.ngig oder unabh.ngig dargestellt. Viertens identifizierten wir gemeinsame und genotypspezifische P-Magelreaktionsmodule und die entsprechenden biologische Prozesse. Schlie.lich konzentrierten wir uns auf Proteinkinasen, die eine Rolle als Regulatoren spielen, um in einem auf Proteinkinasen zentrierten Netzwerk potenzielle Substrate aufzuzeigen. Wir konnten Proteininteraktionen zwischen Mitogen-aktivierter Proteinkinase- Kinase 1 (MEK1, Zm00001d043609) entweder mit Saccharose-Synthase1 (SH1, Zm00001d045042) oder Translationsdehnungsfaktor 1-gamma 3 (eEF1B-γ, Zm00001d046352) experimentell validieren. MEK1 ist ein potenzieller genotypspezifischer Regulator über den Saccharosemetabolismus und den Regulation von Translation. In Kapitel 2 zielten wir darauf ab, einen experimentellen Arbeitsablauf für die Phosphoproteomanalyse in Mais anzupassen und dabei die St.rungen der Phosphoproteom-Quantifizierung durch Fasern, Sekund.rmetaboliten und die geringe H.ufigkeit phosphorylierter Proteine zu berücksichtigen. Wir haben ein schnelles und universelles Protokoll sowohl für die Proteom- als auch für die Phosphoproteomanalyse entwickelt, das sich insbesondere für Material aus Getreidepflanzen eignet. Die Ergebnisse der Phosphoproteomanalyse in Maiswurzelproben zeigten, dass Proteine innerhalb des in Kapitel 1 beschriebenen kinase-zentrierten Netzwerks mit diesem Arbeitsablauf weitgehend quantifiziert werden k.nnen. Es bietet eine M.glichkeit zur Analyse der Phosphorylierungsdynamik im Zusammenhang mit PMangelreaktionen und erm.glicht eine weitere Untersuchung des kinase-zentrierten Netzwerks in Kapitel 1 zur Identifizierung von Phosphorylierungspaaren "Proteinkinase - Proteinsubstrat", was den Blick auf die P-Starvationsregulierung durch posttranslationale Modifikationen erheblich erweitern wird.