Exploiting novel strategies for the production of surfactin in Bacillus subtilis cultures

Abstract

Biosurfactants are synthesized by various microorganisms. These surface-active molecules are a promising alternative to petrochemically and oleochemically produced surfactants. Advantageously, biosurfactants are reported to be better biodegradable and less toxic. The cyclic lipopeptide surfactin synthesized by Bacillus subtilis displays one interesting biosurfactant. Many studies report on the outstanding physico-chemical characteristics and add on benefits such as antimicrobial properties. Hence, surfactin has the potential to be used in a variety of industrial sectors. Nevertheless, processes ensuring both robustness and high titers are rare, especially as conventional aerobic bioreactor cultivations share one major disadvantage, namely excessive foaming. To approach industrial processes, different methods are applied, which can be categorized in three practices. These are (1) media and process parameter optimization, (2) strain engineering, and (3) investigating novel process strategies. For the latter category, the anaerobic growth by nitrate respiration poses an interesting foam-free alternative. In this sense, the anaerobic cultivation of B. subtilis to produce surfactin coupled with the three afore mentioned practices was addressed in this thesis targeting at a foam-free surfactin production process. In the 1st publication, the genome reduced strain B. subtilis IIG-Bs20-5-1, a derivative of the laboratory strain 168 able to synthesize surfactin, was evaluated with respect to its suitability as surfactin producer at various temperatures under both aerobic and anaerobic conditions. It was hypothesized that a deletion of 10% of the genome, e.g., non-essential genes synthesizing prophages or the antibiotic bacilysin, saves metabolic resources and hence results in increased surfactin titers. Strains B. subtilis JABs24, a 168 derivative able to synthesize surfactin but without genome reduction, and the surfactin producer B. subtilis DSM 10T served for comparison. Although strain IIG-Bs20-5-1 was superior regarding specific growth rate µ and biomass yield YX/S, the strain was inferior with respect to surfactin titers, product related yields YP/S and YP/X, and specific productivity q. Indeed, compared to others in literature described strains, B. subtilis JABs24 was emphasized as promising target strain for further process development, reaching high surfactin titers of 1147 mg/L aerobically and 296 mg/L anaerobically as well as exceptionally high product yields YP/X under anaerobic conditions. Accordingly, iterative process optimization was hypothesized to improve anaerobically achieved surfactin titers. However, several aspects to consider of anaerobic growth of B. subtilis by nitrate respiration were described in the 2nd publication. Amongst others, increasing ammonium concentrations, resulting from nitrate reduction to ammonium via nitrite, were shown to have no impact on growth of strain JABs24, but surfactin titers and expression of nitrate reductase promoter PnarG were reduced. Nitrite was shown to peak within the first hours of cultivation and concentrations up to 10 mmol/L resulted in prolonged lag-phases. Moreover, acetate accumulated drastically during the time course of cultivation independent of glucose availability, thus decreasing the glucose flux into biomass. Acetate additionally influenced both specific growth rate µ and PnarG expression negatively. Concluding, the general feasibility of anaerobic fed-batch cultivations to synthesize surfactin was shown, but several aspects must be addressed in future works to make this strategy an equated process with aerobic cultivations. In the 3rd publication, a self-inducible surfactin synthesis process was presented where expression of the surfactin operon in B. subtilis JABs24 was induced under oxygen limited conditions. The native promoter of the srfA operon PsrfA was replaced by anaerobically inducible nitrate reductase promoter PnarG and nitrite reductase promoter PnasD. Shake flask cultivations with varying oxygen availabilities demonstrated that both PnarG and PnasD can serve as auto-inducible promoters. At high oxygen availability, surfactin was not produced in the promoter exchange strains. At lowest oxygen availability, the strain carrying PnarG reached lower surfactin titers than the native JABs24 strain, although expression levels of PnarG and PsrfA were similar. However, strain B. subtilis MG14 with PsrfA::PnasD reached 1.4-fold higher surfactin titers with 696 mg/L and an exceptionally high YP/X of 1.007 g/g with overall lower foam levels. Though, bioreactor cultivations have illustrated that the anaerobic induction must be performed slowly as to avoid cell lysis, resulting in so-defined aerobic-anaerobic switch processes. With further appropriate process optimization, a simple and robust surfactin production process with highly reduced or even no foam formation can be achieved employing strain B. subtilis MG14.

Biotenside, werden von verschiedenen Mikroorganismen synthetisiert und stellen eine Alternative zu petrochemisch und oleochemisch hergestellten oberflächenaktiven Molekülen dar. Biotenside weisen eine bessere biologische Abbaubarkeit auf und besitzen eine geringere Toxizität. Ein interessantes Biotensid ist das von Bacillus subtilis gebildete zyklische Lipopeptid Surfactin. Dieses besitzt vielversprechende physikalisch-chemische Eigenschaften und wirkt zudem antimikrobiell. Daraus resultieren zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten im Lebensmittel-, Kosmetik-, Pharma-, Agrar- und Umweltbereich. Dennoch gibt es wenige in der Literatur beschriebene stabile Prozesse, in welchen hohe Surfactinkonzentrationen erreicht werden. Zudem sind konventionelle aerobe Kultivierungen von einer starken Schaumbildung geprägt. Optimierung von Medien- und Prozessparametern, Stammentwicklung und Untersuchung neuartiger Prozessstrategien stellen drei Ansätze dar, um industriell umsetzbare und lukrative Prozesse zu entwickeln. Die anaerobe Kultivierung von B. subtilis mittels Nitratatmung ist hierbei eine interessante schaumfreie Strategie, welche im Rahmen dieser Thesis die Grundlage bildete und weiter untersucht wurde. In der 1. Publikation wurde B. subtilis IIG-Bs20-5-1, ein Stamm mit einer Genomreduzierung von 10 %, hinsichtlich seiner Eignung als Surfactinproduzent untersucht. Der nicht genomreduzierte Stamm B. subtilis JABs24 sowie B. subtilis DSM 10T dienten als Referenzen. Es wurden aerobe und anaerobe Kultivierungen bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt. Es wurde vermutet, dass eine Deletion von nicht-essenziellen Genen metabolische Ressourcen einspart und zu höheren Surfactinkonzentrationen führt. Der Stamm IIG-Bs20-5-1 war sowohl bei der Wachstumsrate µ als auch in der Biomasse-Ausbeute YX/S überlegen, wies aber geringere Surfactinkonzentrationen, produktbezogene Ausbeuten YP/S und YP/X, und spezifische Produktivitäten q auf. B. subtilis JABs24 wurde allerdings aufgrund seiner hohen Surfactinkonzentrationen, 1147 mg/L aerob und 296 mg/L anaerob, und der unter anaeroben Bedingungen vergleichsweise hohen Produktausbeuten YP/X als vielversprechender Produktionsstamm für weitere Entwicklungen identifiziert. Entsprechend sollten weitere Optimierungen auf Basis des anaeroben Wachstums mit B. subtilis JABs24 folgen, um diese Strategie zu aeroben Prozessen konkurrenzfähig zu machen. Das anaerobe Wachstum mittels Nitratatmung hat allerdings einige Nachteile gegenüber aeroben Prozessen, welche in der 2. Publikation beschrieben wurden. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Nitratatmung steigende Ammoniumkonzentrationen keinen Einfluss auf das Wachstum von B. subtilis JABs24 haben, allerdings zu verringerten Expressionen des Promotors PnarG, welcher für die Nitratatmung essenziell ist, und Surfactinkonzentrationen führten. Nitrit reicherte sich kurzzeitig an und bis zu 10 mmol/L führten zu verlängerten Lag-Phasen. Unabhängig von den Glucoseverfügbarkeiten akkumulierte Acetat kontinuierlich. Es zeigte sich, dass steigende Acetatkonzentrationen sowohl die Wachstumsrate µ als auch die Promotorexpression von PnarG reduzierten. Die anaerobe Kultivierung ist somit eine interessante Prozessführung, jedoch müssen verschiedene Aspekte in zukünftigen Arbeiten untersucht werden, um diesen Prozess zu aeroben Kultivierungen konkurrenzfähig zu machen. In der 3. Publikation wurde ein Prozess beschrieben, bei welchem die Surfactinsynthese in B. subtilis JABs24 durch sauerstofflimitierte Bedingungen induziert wird. Der native Promotor des srfA-Operons PsrfA wurde durch PnarG und PnasD ersetzt, welche unter anaeroben Bedingungen induziert werden. Kultivierungen mit variierendem Sauerstoffgehalt zeigten, dass PnarG und PnasD als autoinduzierbare Promotoren verwendet werden können. Bei hoher Sauerstoffverfügbarkeit wurde in den Promotoraustauschstämmen kein Surfactin detektiert. Bei niedrigsten Sauerstoffgehalten erreichte der Stamm mit PsrfA::PnarG Promotoraustausch geringere Surfactintiter als der native JABs24 Stamm, obwohl die Expressionslevel von PnarG und PsrfA ähnlich waren. B. subtilis MG14 mit PsrfA::PnasD erreichte dagegen 1,4-fach höhere Surfactinkonzentrationen von 696 mg/L und einen vergleichsweise hohen YP/X-Wert von 1,007 g/g. Bioreaktorkultivierungen zeigten zudem, dass die Induktion durch Sauerstoffreduktion über einen größeren Zeitraum durchgeführt werden muss, um eine Zelllyse zu vermeiden, was zu sogenannten aerob-anaeroben Switch-Prozessen führte. Mit weiteren Prozessoptimierungen kann unter Verwendung von B. subtilis MG14 ein einfacher und robuster Prozess mit stark reduzierter oder gar ohne Schaumbildung ermöglicht werden.