Left-right asymmetry in Xenopus laevis : functional dissection of leftward flow

Abstract

Despite their external bilateral symmetry, vertebrates have a conserved left right (LR) asymmetry of their inner organs. For all vertebrates, it is well-known that the asymmetric organogenesis is preceded by the left-sided nodal signaling cascade during embryonic development. A question which has not been settled in detail is how the first asymmetrically directed signal arises, which activates nodal only on the left side. In mice and fish embryos an extracellular leftward fluid flow ? generated by rotating cilia ? was shown to be functionally necessary for gene activation. Recently, this process has also been demonstrated in frog embryos and its mechanic inhibition caused laterality defects. This raised the question if this process is also conserved among vertebrates. The aim of this study was to analyze the mechanism of flow in the frog in the context of the known models. Thereby, its prerequisites and the exact mode of activation of the left-sided genes should be assessed. Finally, general conclusions on the symmetry breakage of vertebrates were to be drawn. Loss of function of axonemal dynein heavy chains inhibited ciliary movement, fluid flow and laterality development of the embryos. By showing that flow was only necessary on the left half of the ciliated epithelium (GRP), definite statements could be made concerning origin, identity and possibility of a transported substance. Moreover, a function for GRP morphogenesis and thus for the generation of flow were proven for the serotonin receptor 3 and the calcium channel Pkd2. These results did not confirm the hypothesis that Pkd2 causes a flow-dependent left-sided calcium signal. Consequently, this contradicted the so-called "2-cilia model" in favor of an early morphogenetic function in frog. In the course of a collaboration it could be shown, that the RNA-binding protein xBic-C has a conserved function for cilia polarization and thus for the flow in both Xenopus and mice. Additionally, up to now, a right-sided nodal inhibitory function has been assigned to the protein coco. However, the exact mechanism was unknown. By specific, combined left- and right-sided loss of function experiments with coco, nodal and the above mentioned components, it could be demonstrated that coco but not nodal is directly dependent on leftward flow. With the flow, coco was downregulated on the left side only and could thus no longer inhibit nodal there. Loss of flow or xBic-C function ? but not that of Pkd2 ? could be rescued by coco inhibition; this revealed a clear hierarchy. Taken together a sequence of conditions could be formulated: Pkd2 and the serotonin receptor 3 are obligatory for the formation of the GRP and correct flow before neurulation. xBic-C also precedes the flow and is required for cilia polarization but seemed also to have a further function. coco is downstream of the fluid flow and is downregulated as its direct consequence on the left side. nodal, in turn, is downstream of this order and is only released on the left side where it can thus act as a putative mediator to transfer the generated signal into the lateral plate mesoderm. These results are discussed in terms of evolutionary origin and conservation.

Trotz ihrer äußeren Bilateralsymmetrie weisen Wirbeltiere eine konservierte Links-Rechts (LR)-Asymmetrie der inneren Organe auf. Es ist bekannt, dass bei allen Vertebraten der embryonalen, asymmetrischen Organogenese die linksseitig aktive nodal-Signalkaskade vorangeht. Eine im Detail noch nicht geklärte Frage ist, wie das erste asymmetrisch gerichtete Signal entsteht, welches nodal nur links aktiviert. In Maus- und Fischembryonen wurde ein durch rotierende Cilien erzeugter, linksgerichteter extrazellulärer Flüssigkeitsstrom für die Genaktivierung als funktionell notwendig nachgewiesen. Vor kurzem wurde gezeigt, dass solch ein Prozess auch im Froschembryo stattfindet und dessen mechanische Inhibition Lateralitätsdefekte zur Folge hat. Dadurch stellte sich die Frage, ob dieser Vorgang ebenfalls konserviert ist. Das Ziel dieser Arbeit war es, vor dem Hintergrund bekannter Modelle den genauen Mechanismus des Flüssigkeitsstroms, seine Voraussetzungen und den Modus der genauen Aktivierung der linksseitigen Gene am Froschmodell zu untersuchen. Damit sollten letztlich allgemeine Schlussfolgerungen zum Symmetriebruch der Wirbeltiere gezogen werde. Der Funktionsverlust von axonemalen schweren Dyneinketten führte zur Störung der Cilienbewegung, des Flüssigkeitsstroms und damit zu Lateralitätsproblemen der Embryonen. Es konnte gezeigt werden, dass der Flüssigkeitsstrom nur auf der linken Hälfte des cilierten Epithels (GRP) nötig war, wodurch klare Aussagen über Herkunft, Identität und Möglichkeit einer transportierten Substanz gemacht werden konnten. Weiter wurden für den Serotonin-Rezeptor 3 und den Calciumkanal Pkd2 eine Funktion für die Morphogenese der GRP und damit für die Entstehung des Flüssigkeitsstromes nachgewiesen. Diese Resultate bestätigten nicht die Hypothese, dass Pkd2 ein stromabhängiges linksseitiges Calcium-Signal erzeugt und somit auch nicht das so genannte ?2-Cilien Modell?, sondern favorisiert eine frühe morphogenetische Funktion im Frosch. Für das RNA-Bindeprotein xBic-C konnte im Rahmen einer Kollaboration eine konservierte Funktion für korrekte Cilienpolarität und damit für den Flüssigkeitsstrom in Xenopus und Maus gezeigt werden. Dem nodal-Inhibitor coco wurde bisher eine rechtsseitige Funktion zugeschrieben, der genaue Mechanismus war jedoch unbekannt. Durch gezielte, kombinierte links- und rechtsseitige Funktionsverlust-Experimente mit coco, nodal und den oben genannten Komponenten, konnte gezeigt werden, dass coco aber nicht nodal vom linksgerichteten Flüssigkeitsstrom direkt abhängig ist. Es wird von diesem linksseitig runterreguliert und hemmt dadurch nodal dort nicht mehr. Der Verlust der Flüssigkeitsströmung oder der Funktion von xBic-C, nicht aber von Pkd2 konnten durch coco-Inhibition gerettet werden; dies zeigte eine klare Hierarchie. Zusammengefasst kann damit eine Abfolge von Bedingungen formuliert werden: Pkd2 und der Serotonin-Rezeptor 3 sind zwingend nötig für die Bildung der GRP und einen funktionellen Flüssigkeitsstrom. xBic-C ist diesem ebenfalls vorangestellt und für die Cilienpolarisierung nötig, scheint aber auch noch eine weitere Funktion zu haben. Coco ist dem Flüssigkeitsstrom nachgeschaltet und wird als dessen direkte Konsequenz links herunterreguliert. nodal wiederum ist dieser Rangfolge nachgeschaltet und wird als Vermittler des Signals linksseitig von der Hemmung freigesetzt und kann so als Vermittler für die Weiterleitung des generierten Signals ins Seitenplattenmesoderm fungieren. Die Ergebnisse werden im Kontext des evolutionäre Ursprungs und der Konservierung diskutiert.