Einfluss der IgG-Subklassen sowie der immunmodulatorischen Aminosäuren Arginin und Glutamin auf die Aktivierung menschlicher Darmmastzellen

Abstract

Mast cells are key effector cells in allergic diseases, like food allergy. Activation of mast cells occurs mainly by crosslinking of immunoglobulin E (IgE) receptor FcεRI. The role of allergen specific immunoglobulin G (IgG) subclasses IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 in activation of intestinal mast cells is not yet fully clarified. On the one hand, mast cells can be activated via IgG1 and by the mechanisms of ?IgG-supercrosslinking?. On the other hand, IgG1 and IgG4 are up regulated during immunotherapy and might be able to attenuate allergic reactions. In this work, we investigated the effect of IgG subclasses on IgE dependent and IgE-independent mediator release of human intestinal mast cells. Mast cells, isolated and purified from human intestinal tissue, were cultured with their growth factor stem cell factor (SCF) in combination with interferon γ (IFN-γ) or with interleukin 4 (IL-4). IFN-γ is known to up regulate expression of the activating IgG receptor FcγRI on mast cells, derived from peripheral blood. IL-4 is known to enhance IgE triggered mediator release from human intestinal mast cells. Expression of FcγRI, FcγRII, FcγRIII and FcεRI was analysed by flow cytometry. IgG subclasses should be isolated from human sera by affinity chromatography. However, the required purity of at least 95 % for each subclass could not be achieved. Thus, intestinal mast cells were stimulated with human myeloma IgG1-4 and their specific anti-IgG1-4 antibodies in combination with IgE/anti-IgE and the release of inflammatory mediators was measured. We could show that human intestinal mast cells cultured with IFN-γ express FcγRI, while FcγRII and FcγRIII were only weakly expressed. Mast cells cultured with IL-4 do not express FcγR. IgG subclasses themselves did not activate intestinal mast cells neither in culture with IFN-γ, nor cultured with IL-4. In combination with IgE/anti-IgE, the IgG subclasses IgG1/anti IgG1, IgG2/anti IgG2 and IgG4/anti IgG4 tended to decrease the release of pre-stored β-hexosaminidase and de novo synthesized leukotriene C4 (LTC4) but the reduction was not significant. To conclude, IFN-γ induced in human intestinal mast cells the expression of FcγRI, but this did not result in stimulation of the cells by IgG. Thus, human intestinal mast cells do not respond or only to a small extend to IgG subclasses and differ from mast cells derived from peripheral blood which could be activated via IgG1. The second part of the work examines the effect of the immunomodulatory amino acids arginine and glutamine on IgE-dependent activation of human intestinal mast cells. Background was the measured anti-inflammatory effect of combined pharmacological doses of both amino acids on intestinal biopsies from patients with Crohn?s disease. Beside allergic diseases, mast cells play a role in chronic intestinal inflammation. Therefore, they could be involved in the described effect. Human intestinal mast cells were incubated over night with combined physiological doses or pharmacological doses of arginine (0.1 mmol/L or 2 mmol/l) and glutamine (0.6 mmol/l or 10 mmol/l). Mast cells were stimulated with IgE/anti-IgE and release of β-hexosaminidase and LTC4, induction of cytokines and activation of signaling molecules was analysed. In human intestinal mast cells, cultured in SCF and IL-4, combined pharmacological concentrations of arginine and glutamine led to decreased release of LTC4 about 40 ± 22 % and to reduced induction of cytokines like CCL2 (monocyte chemotactic protein 1), CCL4 (macrophage inflammatory protein 1 beta), CXCL8 (IL-8), and TNF (tumor growth factor alpha) about an average of 58 ± 35 % compared to physiological doses of arginine and glutamine. The anti-inflammatory effects of arginine and glutamine were associated with decreased activation levels of MAP kinases like ERK1/2, p38, JNK pan und MEK1/2 about 38 ± 17 % as well as serine/threonine kinase Akt about 23 ± 20 %. Therewith, arginine and glutamine reduce activation levels of signaling molecules known to be involved in IgE dependent mast cell cytokine expression. Here, the results show that arginine and glutamine exert anti-inflammatory effects on human intestinal mast cells in vitro. Further investigations are necessary to monitor these findings in vivo prior to use arginine and glutamine as immunomodulatory agents in inflammatory and allergic diseases.

Mastzellen sind die Haupteffektorzellen in allergischen Erkrankungen, u. a. der Nahrungsmittelallergie. Die Aktivierung erfolgt dabei primär über die Kreuzvernetzung des Immunglobulin E (IgE) Rezeptors FcεRI. Die Bedeutung von Immunglobulin G (IgG) -Subklassen IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 für die Stimulation von intestinalen Mastzellen ist bisher nicht eindeutig geklärt. Einerseits können Mastzellen über IgG1 sowie den Mechanismus der ?IgG-Superkreuzvernetzung? aktiviert werden. Andererseits werden IgG1 und IgG4 im Rahmen einer Immuntherapie vermehrt gebildet und könnten daher die allergische Reaktion abschwächen. In dieser Arbeit wurde die Rolle der IgG-Subklassen auf die IgE-abhängige als auch auf die IgE-unabhängige Freisetzung von Mediatoren in menschlichen Darmmastzellen untersucht. Mastzellen wurden aus menschlichem Darmgewebe isoliert, aufgereinigt und mit ihrem Wachstumsfaktor stem cell factor (SCF) in Kombination mit Interferon-γ (IFN-γ) bzw. Interleukin 4 (IL-4) kultiviert. Von IFN-γ ist bekannt, dass es die Expression des aktivierenden IgG-Rezeptors FcγRI in aus peripherem Blut hergeleiteten Mastzellen hochreguliert. IL-4 erhöht die IgE-vermittelte Mediatorfreisetzung von menschlichen Darmmastzellen. Die Expression von Fcγ;RI, FcγRII, FcγRIII und FcεRI wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Zur Untersuchung der Wirkung von IgG-Subklassen sollten diese anhand der Affinitätschromatographie aus menschlichem Serum isoliert werden. Die erforderliche Reinheit der einzelnen IgG-Subklassen von mindestens 95 % wurde aber nicht erreicht. Daher wurden Darmmastzellen mit menschlichem myeloma IgG1-4 und deren spezifischen Antikörpern anti-IgG1-4 in Kombination mit IgE/anti-IgE stimuliert und die Mediatorfreisetzung gemessen. Wir konnten zeigen, dass menschliche Darmmastzellen in Kultur mit IFN-γ FcγRI exprimieren, während FcγRII und FcγRIII dagegen nur marginal nachgewiesen werden konnten. Mastzellen nach Kultur mit IL-4 exprimierten keinen FcγR. Die IgG-Subklassen allein führten weder nach Kultur mit IFN-γ noch nach Kultur mit IL-4 zu einer Aktivierung der Darmmastzellen. In Kombination mit IgE/anti-IgE zeigten IgG1/anti-IgG1, IgG2/anti-IgG2 und IgG4/anti-IgG4 in mit IFN-γ kultivierten Darmmastzellen einen tendenziellen, aber nicht signifikanten, Rückgang der Ausschüttung des gespeicherten Mastzellmediators β-Hexosaminidase und des de novo synthetisierten Lipidmediators Leukotrien C4 (LTC4). Somit reagieren menschliche Darmmastzellen kaum oder nur wenig auf IgG-Subklassen und weisen damit ein von aus peripherem Blut hergeleiteten Mastzellen abweichendes Verhalten auf, welche über IgG1 aktivierbar sind. Im zweiten Teil der Arbeit sollte der Einfluss der immunmodulierenden Aminosäuren Arginin und Glutamin auf die IgE-abhängige Aktivierung von menschlichen Darmmastzellen untersucht werden. Hintergrund war die Beobachtung, dass die Behandlung mit kombinierten pharmakologischen Dosen beider Aminosäuren anti-inflammatorische Effekte auf Darmbiopsien von Morbus Crohn Patienten ausübte. Mastzellen spielen neben allergischen Erkrankungen auch eine Rolle bei chronischen Darmentzündungen. Sie könnten daher in die beobachteten Effekte involviert sein. Menschliche Darmmastzellen wurden über Nacht mit kombinierten physiologischen oder pharmakologischen Konzentrationen an Arginin (0,6 bzw. 2 mM/l) und Glutamin (0,6 bzw. 10 mM/l) inkubiert. Die Mastzellen wurden mit IgE/anti-IgE stimuliert und es wurde die Freisetzung von β-Hexosamindase und LTC4, die Induktion von Zytokinen sowie die Aktivierung von Signalmolekülen analysiert. Kombinierte pharmakologische Dosen an Arginin und Glutamin führten in mit SCF und IL-4 kultivierten menschlichen Darmmastzellen zu einer verringerten Freisetzung von LTC4 um 40 ± 22 % sowie zu einer verringerten Induktion der Zytokine/Chemokine CCL2 (monocyte chemotactic protein 1), CCL4 (macrophage inflammatory protein 1 beta), CXCL8 (IL-8), und TNF (tumor necrosis factor alpha) um durchschnittlich 58 ± 35 % verglichen mit kombinierten physiologischen Dosen an Arginin und Glutamin. Die anti-inflammatorischen Effekte von Arginin und Glutamin waren verbunden mit einer verringerten Aktivierung der MAP Kinasen ERK1/2, p38, JNK pan und MEK1/2 um 38 ± 17 % sowie der Serin/Threonin Kinase Akt um 23 ± 20 %. Damit senkten Arginin und Glutamin die Aktivierung von Signalproteinen, welche bei der IgE-vermittelten Aktivierung von Darmmastzellen eine Rolle spielen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Arginin und Glutamin in vitro anti-inflammatorische Effekte auf menschliche Darmmastzellen ausüben. Untersuchungen in vivo sind nötig um zu überprüfen, inwiefern Arginin und Glutamin als immunfördernde Substanzen bei entzündlichen oder allergischen Erkrankungen eingesetzt werden können.