Plasmopara viticola, the downy mildew of grapevine : phenotypic and molecular characterization of single sporangium strains infecting hosts with different resistance levels

Abstract

The downy mildew of grapevine, Plasmopara viticola, is one of the most important pathogens in viticulture. Its genetic diversity had been assessed in some previous studies using molecular markers, but the diversity of the infection behavior has not yet been addressed adequately. Therefore, the development of a fast, reliable and uncomplicated assay to screen for pathogen phenotypes on host with different resistance levels was a major task of this work. A leaf disc test was proposed, evaluating sporulation and necrosis produced by the pathogen on Vitis plants with different susceptibility. Using this bioassay, interesting strains were assessed and kept for future studies. The urgent need to work with genetic homogeneous inoculum was shown, because the assays revealed a high phenotypic diversity in isolates collected from the field as a bulk sample. Hence, a cloning technique to obtain single sporangium strains was found useful to avoid working with mixed genotypes. The leaf disc bioassay also allowed screening for fungicide resistance in P. viticola populations. Isolates resistant to dimethomorph and metalaxyl, two important fungicides for oomycetes control, were detected. Higher resistance was associated with fields were the fungicide application was high as well. Some strains were even resistant to doses where the fungicide exhibits phytotoxic activity to grapevine. The approach of characterizing P. viticola pathotypes on different host plants of Vitis vinifera cultivars and Vitis species from North America and Asia revealed a broad spectrum of fully susceptible to completely resistant reactions. This information is of direct practical value in future plant breeding programs, but also provides the chance to select specific host-pathogen combinations to study the mechanisms of resistance or susceptibility. Fluorescence microscopy revealed how the infection progress of highly and lowly virulent strains advance in tolerant and susceptible hosts, and which points of the infection are interesting for future studies. On the molecular level, effectors were investigated to trace their possible involvement in the infection process. It was found that RXLR 1, NLP 1, Elicitin like 2, Glucanase inhibitor 2 and 4 , and 1,3-ß Glucanase 2 are candidates which are upregulated in the earliest infection stages. Following the here established methodology and suggested strategy it should be possible in the future to get a better insight in the mechanisms of infection and resistance of grapevine downy mildew.

Der Falsche Mehltauerreger von Wein, Plasmopara viticola, ist eines der wichtigsten Pathogene im Weinbau. In vorherigen Studien wurde die genetische Diversität diese Pathogens mittels molekularer Marker evaluiert, jedoch erfolgten keine aussagekräftigen Untersuchungen bezüglich der phänotypischen Diversität. Aus diesem Grund war die Entwicklung einer unkomplizierten Methode, verschiedene Genotypen des Pathogens durch Biotests zu unterscheiden, eines der Hauptziele dieser Arbeit. Hierzu wurde ein Blattscheibentest mit unterschiedlich anfälligen Vitis Kultivaren entwickelt. Für die Bewertung der Pathogene wurden Parameter wie die Art der verursachten Sporulation sowie Nekrosenbildung ermittelt. Durch Verwendung dieses Biotests, konnten interessante Pathogenstämme identifiziert und für zukünftige Studien gezielt vermehrt werden. Hierbei zeigte sich die dringende Notwendigkeit, mit einem genetisch homogenen Inokulum zu arbeiten, da eine hohe phänotypische Diversität in Feld Isolaten experimentell nachgewiesen wurde. Um die Arbeit mit Mischisolaten zu vermeiden wurden durch ein Klonierungsverfahren Stämme aus einzelnen Sporangien herangezogen. Der entwickelte Blattscheibentest ermöglichte auch das Screening auf Fungizid Resistenzen in P. viticola Populationen. Resistente Stämme gegen Dimethomorph und Metalaxyl, zwei bedeutende Fungizide für die Bekämpfung dieses Oomyceten, wurden hierbei nachgewiesen. Dabei wurden hohe Resistenzen mit Feldern, in denen die Fungizid Anwendung ebenfalls hoch war, assoziiert. Es wurden sogar einige Stämme identifiziert, die gegen sehr hohe Dosen, zum Teil bereits im phytotoxischen Bereich für die Weinrebe, Resistenz aufwiesen. Die P. viticola Pathotyp Charakterisierung mit verschiedenen Vitis vinifera Kultivaren sowie Vitis Arten aus Nord Amerika und Asien zeigte ein breiteres Spektrum von komplett anfälligen bis zu komplett resistenten Reaktionen. Diese Information kann in künftigen Züchtungsprogrammen direkt angewendet werden. Zusätzlich ermöglicht diese Methode auch die Auswahl interessanter Wirt-Pathogen Kombinationen. Diese Kombinationen sollen genutzt werden, um die Mechanismen, welche für die Resistenz verantwortlich sind, zu untersuchen. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zeigten wie sich die Infektionsverläufe von hoch und niedrig virulenten Pathogenstämmen in toleranten und anfälligen Wirten verbreiten. Hierbei konnten auch die, für weitere Studien interessanten Zeitpunkte der Infektion, ermittelt werden. Einige der, so ermittelten, Zeitpunkte, sowie sehr frühe Stadien der Infektion, wurden auf molekularer Ebene untersucht. Anschließend wurden verschiedene Effektoren betrachtet um deren Beteiligung während des Infektionsprozesses nachzuvollziehen. Es wurde festgestellt, dass RXLR 1, NLP 1, Elicitin like 2, Glucanase inhibitor 2 and 4, and 1,3-ß Glucanase 2 Kandidaten für Gene sind, die in frühen Entwicklungsphasen der Sporen hochreguliert werden. Die Benutzung der hier etablierten Methode und vorgeschlagene Strategie solle künftig ein besseren Einblick des Infektionsmechanismus und Resistenz gegen Falschen Mehltaus ermöglichen.