Effects of overexpression of NIMIN genes on salicylic acid-mediated PR-1 gene activation and phenotype in Nicotiana benthamiana (Domin)

Abstract

Systemic acquired resistance (SAR) is a whole plant resistance mechanism, launched after initial exposure to a necrotizing pathogen. At molecular level, SAR is characterized by elevated level of plant hormone salicylic acid (SA) and induction of pathogenesis-related (PR) proteins. During SAR, SA signal is transduced through regulatory protein NPR1 (Non-Expressor of PR Genes1; also known as NIM1 or SAI1) leading to the induction of the SAR marker PR-1. Present data strongly suggest that the SA signal is directly perceived by NPR1. NPR1 interacts with two classes of proteins. DNA binding TGA factors link the SA sensor NPR1 to the as-1 like cis-acting elements present in the promoter region of PR-1 gene. In addition, NPR1 interacts with NIM1-interacting (NIMIN) proteins. In Arabidopsis, there are four NIMIN genes, i.e., NIMIN1, NIMIN1b, NIMIN2 and NIMIN3. Initially, it was hypothesized that, although structurally related to each other, NIMIN proteins might play diverse functions during SAR response. Indeed, it has been shown that the NIMIN genes are expressed differentially and that the encoded proteins interact differentially with NPR1. Based on these observations, NIMIN proteins have gained much attention. The functional significance of NIMIN proteins in SAR pathway has been addressed in overexpression studies. Overexpression of NIMIN1 yielded strong suppression of PR gene induction and enhanced susceptibility to a bacterial pathogen in transgenic Arabidopsis. Apart from NIMIN1, the functional significance of other Arabidopsis NIMIN family members has not yet been addressed. Therefore, present research is conducted to explore the biological significance of other NIMIN family members from Arabidopsis as well as tobacco. To this end, transient gene expression in a N. benthamiana reporter line containing a -1533PR-1apro:GUS construct was employed. The research achievements of this work are listed below. 1. The N. benthamiana infiltration procedure was optimized for reliable determination of -1533PR-1apro:GUS reporter gene activation in presence of different Agrobacterium strains. 2. After optimization, transient gene expression system (TGES) was successfully used to uncover the functional significance of NIMIN proteins on SA-mediated PR-1a gene induction. NIMIN1 and NIMIN1b are categorized as strong, NIMIN3 as an intermediate and NIMIN2 as a non-suppressor of SA-mediated PR-1a reporter gene activation. 3. Interestingly, suppressing NIMIN1, NIMIN1b and NIMIN3 all contain an EDF (glutamic acid, aspartatic acid, phenylalanine) motif. Therefore, EDF mutants were generated in NIMIN1 and NIMIN3, i.e., NIMIN1 E94A D95V and NIMIN3 E63A D64V, respectively. Yeast two-hybrid (Y2H) data show that NIMIN1 E94A D95V still interacts with NPR1, while NIMIN3 E63A D64V interaction with NPR1 could not be validated due to undetectable accumulation of the mutant fusion protein in yeast. In the TGES, NIMIN1 E94A D95V and NIMIN3 E63A D64V were not able to suppress the SA-mediated PR-1a promoter activation. The data support the fact that the EDF motif may have a function in NIMIN proteins interaction with NPR1, thereby, regulating PR-1 gene induction. 4. EAR domain is generally considered as a repression domain and also exists in NIMIN proteins. The deletion mutants, i.e., NIMIN1 1/137 and NIMIN1b 1/135 still suppress the SA-induced -1533PR-1apro:GUS gene activation. On the other hand, NIMIN1 L138A L140A and NIMIN3 L108A L110A do not suppress the SA-mediated reporter gene induction. But that is because of low overall accumulation of mutant proteins in N. benthamiana leaf tissues. Thus, the data support the view that EAR domain is not the only repressional domain active in NIMIN proteins. 5. Like Arabidopsis, tobacco also contains NIMIN genes. During this study, a novel NIMIN gene from tobacco, NIMIN-like1, was cloned and characterized. Using Y2H analyses, it was shown that NIMIN-like1 binds to NgNPR1 and that interaction is sensitive to SA. Thus, NIMIN-like1 falls into the tobacco NIMIN family. Thereafter, functional significance of diverse tobacco NIMIN proteins for their effects on SA-mediated PR-1a gene induction via TGES was carried out. NIMIN2c and NIMIN-like1 are categorized as strong suppressors, whereas NIMIN2a is a weak suppressor of SA-mediated PR-1a reporter gene induction. 6. NIMIN1 and NIMIN3 overexpression manifests cell death in N. benthamiana, and cell death is accompanied by the accumulation of H2O2. No correlation was found between NIMIN proteins binding intensity to NPR1 and cell death. Similarly, no correlation was found between PR-1a reporter gene suppression and cell death. The data support the view that the EDF and EAR motifs are not involved in cell death phenomenon. Based on previous and data gathered in this study, a model for the hypothetical play of sequential interaction of NIMIN proteins with NPR1 in course of SAR is presented.

Systemisch aktivierte Resistenz (SAR) ist ein Resistenzmechanismus der Pflanze, der nach einem initialen Kontakt mit nekrotisierenden Pathogenen in Gang gesetzt wird. Auf molekularer Ebene zeichnet sich SAR durch erhöhte Konzentrationen des Pflanzenhormons Salicylsäure (SA) und der Induktion von pathogenesis-related (PR) Proteinen aus. Während der SAR wird das SA-Signal durch das Regulatorprotein NPR1 (Non-Expressor of PR Genes 1; auch bekannt als NIM1 oder SAI1) übermittelt, was zur Induktion des SAR-Markers PR-1 führt. Das SA-Signal wird vermutlich direkt von NPR1 erkannt. NPR1 interagiert mit zwei Klassen von Proteinen. DNA-bindende-TGA-Faktoren verbinden den SA-Sensor NPR1 mit as-1 ähnlichen cis-aktivierenden Elementen in der Promotorregion des PR-1 Gens. Zusätzlich interagiert NPR1 mit NIM1-interagierenden (NIMIN) Proteinen. In Arabidopsis gibt es vier NIMIN-Gene: NIMIN1, NIMIN1b, NIMIN2 und NIMIN3. Anfangs wurde die Hypothese aufgestellt, dass die verschiedenen NIMIN-Proteine trotz ihrer ähnlichen Struktur verschiedene Funktionen bei der SAR-Antwort erfüllen. Tatsächlich wurde gezeigt, dass die NIMIN-Gene verschieden exprimiert werden und die kodierten Proteine auf unterschiedliche Weise mit NPR1 interagieren. Die Rolle der NIMIN-Proteine beim SAR-Mechanismus wurde in Überexpressionsstudien untersucht. Überexpression von NIMIN1 führte zur starken Suppression der PR-Gen-Induktion und erhöhte die Anfälligkeit transgener Arabidopsis-Planzen gegenüber bakteriellen Pathogenen. Abgesehen von NIMIN1 wurde die Funktion der anderen NIMIN-Proteine aus Arabidopsis noch nicht untersucht. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit die Aktivitäten der anderen Mitglieder der Arabidopsis NIMIN-Familie wie auch von Tabak NIMIN-Proteinen untersucht. Dazu wurde transiente Genexpression in einer N. benthamiana Reporter-Linie mit einer -1533PR-1apro:GUS Konstruktion verwendet. Die Forschungsergebnisse dieser Arbeit sind im Folgenden aufgelistet. 1. Die Infiltration von Agrobacterium in N. benthamiana wurde optimiert, um die Aktivierung des Reportergens -1533PR-1apro:GUS verlässlich messen zu können. 2. Nach der Optimierung wurde das transiente Genexpressionssystem (TGES) erfolgreich eingesetzt, um die funktionelle Bedeutung der NIMIN-Proteine für die SA-vermittelte PR-1a Geninduktion zu bestimmen. NIMIN1 und NIMIN1b sind starke, NIMIN3 ein mittlerer und NIMIN2 ein Nicht-Suppressor des SA-regulierten PR-1a Reportergens. 3. Interessanterweise enthalten alle reprimierenden Proteine, NIMIN1, NIMIN1b, und NIMIN3, ein EDF-Motiv (Glutaminsäure, Asparaginsäure, Phenylalanin). In NIMIN1 und NIMIN3 wurden EDF-Mutanten generiert, nämlich NIMIN1 E94A D95V bzw. NIMIN3 E63A D64V. Hefe-zweihybridsystem (Y2H)-Daten zeigen, dass NIMIN1 E94A D95V immer noch mit NPR1 interagiert, während die Interaktion von NIMIN3 E63A D64V mit NPR1 nicht validiert werden konnte, da das mutante Protein in Hefezellen nicht akkumulierte. Im TGES konnten NIMIN1 E94A D95V und NIMIN3 E63A D64V die Aktivierung des PR-1a Promotors durch SA nicht unterdrücken. Die Daten lassen den Schluss zu, dass das EDF-Motiv eine Funktion bei der Interaktion der NIMIN-Proteine mit NPR1 einnehmen, und so die PR-1 Geninduktion regulieren könnte. 4. Die EAR-Domäne wird generell als eine Repressions-Domäne angesehen und existiert auch in NIMIN-Proteinen. Die Deletions-Mutanten, NIMIN1 1/137 und NIMIN1b 1/135, unterdrücken dennoch die SA-induzierte Aktivierung des -1533PR-1apro:GUS-Gens. Auf der anderen Seite unterdrücken NIMIN1 L138A L140A und NIMIN3 L108A L110A nicht die SA-vermittelte Induktion des Reportergens. Aber das ist auf die niedrige Akkumulation von mutanten Proteinen in Blattgewebe von N. benthamiana zurückzuführen. Die Daten lassen also den Schluss zu, dass die EAR-Domäne nicht die einzige Repressions-Domäne ist, die in NIMIN-Proteinen aktiv ist. 5. Wie Arabidopsis enthält auch Tabak NIMIN-Gene. Es wurde ein neues NIMIN-Gen aus Tabak, NIMIN-like1, kloniert und charakterisiert. Durch Y2H-Analyse wurde gezeigt, dass NIMIN-like1 an NgNPR1 bindet und diese Interaktion sensitiv für SA ist. Folglich gehört NIMIN-like1 zur Tabak-NIMIN-Familie. Daraufhin wurde die funktionelle Bedeutung diverser Tabak-NIMIN-Proteine auf die SA-vermittelte PR-1a-Geninduktion mithilfe von TGES ausgetestet. NIMIN2c und NIMIN-like1 werden als starke Suppressoren kategorisiert, während NIMIN2a ein schwacher Suppressor der SA-vermittelten PR-1a Reportergen-Induktion ist. 6. Die Überexpression von NIMIN1 und NIMIN3 führt in N. benthamiana zu Zelltod; der von H2O2-Akkumulation begleitet ist. Es wurde keine Korrelation zwischen der Bindungsintensität der NIMIN-Proteine an NPR1 und Zelltodinduktion gefunden. Gleichermaßen wurde keine Korrelation zwischen der PR-1a Reportergen-Suppression und Zelltod gefunden. Die Daten lassen den Schluss zu, dass die EDF- und EAR-Motive nicht an der Auslösung des Zelltod-Phänomens beteiligt sind. Basierend auf anderen und den in dieser Studie generierten Daten wird ein Modell für die aufeinanderfolgende Interaktion von NIMIN-Proteinen mit NPR1 und ihr hypothetisches Zusammenspiel im Laufe der SAR präsentiert.