Multiple Funktionen des FGF-Signalwegs regulieren die Lateralitätsentwicklung im Krallenfrosch Xenopus

Abstract

Early embryogenesis governs the formation of the three body axis. Like in a cartesian coordinate system, the LR-axis is defined by the generation of the anterior-posterior and the dorso-ventral axis. In the course of laterality specification, the original LR-symmetry has to be broken to enable the asymmetric arrangement of inner organs in a specific manner. This is mediated by the expression of conserved gene cascade, namely the Nodal gene cascade, which is expressed in the left but not in the right lateral plate mesoderm of the neurula stage embryo. Symmetry breakage, which leads up to this asymmetric Nodal gene cascade, is manifested by a cilia-based leftward fluid flow. The flow generating epithelium is located at the posterior end of the notochord and expresses Nodal in a bilateral symmetrical mode. This early Nodal domain is a prerequisite of the later asymmetric Nodal gene cascade. Despite the conserved nature of Nodal expression and of leftward flow, no conservation of the role of the FGF signaling has been described for mouse, chick, rabbit and zebrafish. In this work the role of FGF signaling in Xenopus laevis LR-development was investigated. Using of a receptor antagonist to inhibit FGF signaling revealed two temporally distinguishable functions. Firstly, FGF signaling in early gastrula stages is required for the proper expression of FoxJ1, the master control gene of motile cilia. Here, FGF signaling acts in the process of ciliogenesis of the symmetry-breaking epithelium, which is represented by the GRP (“gastrocoel roof plate”) in Xenopus. Secondly, FGF acts in a cilia-independent manner on the bilateral Nodal expression. A series of descriptive and functional studies revealed that these cells constitute the somitic part of the GRP and that inhibition of FGF signaling leads to the loss of these cells. Interestingly, the effect on ciliogenesis is consistent with the role of FGF signaling in zebrafish, whereas the loss of bilateral Nodal expression is in line with the hypomorpic Fgf8 mutant mouse. The description of these two successive functions in Xenopus indicates a higher degree of conservation of the role of FGF signaling than suggested so far. The FGF signaling pathway splits into several branches, two of which play important roles in the early development of Xenopus embryos. Activation of MAPK signaling is implicated in the induction of mesoderm, whereas the PLC/PKC/Calcium signaling branch impacts on morphogenetic movements. FGF-mediated control of Foxj1 expression was temporally correlated with FGF signaling that acts on mesoderm specification. As a consequence, mesodermal gene expression and blastopore closure was seriously affected by loss of FGF signaling at early gastrula stages. By starting inhibition experiments during gastrula stages, when mesoderm induction is almost finished, general mesoderm specification defects were avoided but the effect on the somitic GRP cells persisted. To unravel which FGF-induced signaling branch acted on the two different functions of FGF described here, the PLC/PKC/Calcium signaling branch was inhibited using the antagonist Sprouty1. Sprouty1 gain of function experiments had no effect on ciliogenesis, but caused loss of somitic GRP cells comparable to loss of function experiments using the FGF receptor antagonist. This suggests that the FGF-dependent formation of these cells is regulated by the PLC/PKC/Calcium pathway. A specific role of Calcium was supported by experiments using a calcium-permeable channel. Despite this, ciliogenesis was not affected by inhibition of PLC/PKC/Calcium, suggesting a role of MAPK for the early function of FGF. In conclusion, this work demonstrates two functions of FGF signaling in Xenopus LR-development, which furthermore are consistent with a conserved function of FGF signaling in vertebrate LR-axis determination. Novel insights into the role of FGF signalling in the very cells which sense leftward flow at the lateral margin of the GRP will open new approaches to analyse laterality specification in more detail.

Während der Embryonalentwicklung muss die Lateralität etabliert werden, d.h. die ursprüngliche Symmetrie der links-rechts Achse muss gebrochen werden, um die asymmetrische Anordnung der inneren Organe zu ermöglichen. Dabei werden die Organe nicht zufällig, sondern in einem bestimmten Muster angeordnet. Dies wird durch die Expression der konservierten Nodal-Genkaskade gewährleistet, die asymmetrisch im linken Seitenplattenmesoderm exprimiert wird. Der Bruch der Symmetrie, welcher zu dieser asymmetrischen Nodal-Kaskade führt, wird über einen linksgerichteten Flüssigkeitsstrom vermittelt, der wiederum durch die rotierende Bewegung motiler Cilien entsteht. Das Epithel, das den Flüssigkeitsstrom erzeugt, findet sich im Bereich des posterioren Notochords und weist lateral auf beiden Seiten eine symmetrische Expression von Nodal auf. Diese frühe bilaterale Nodal-Domäne ist Vorraussetzung für die Induktion der asymmetrischen Nodal-Kaskade. Während Nodal-Funktion und Flüssigkeitsstrom innerhalb der Wirbeltiere weitgehend konserviert sind, wurden für den FGF-Signalweg divergierende Funktionen in der Lateralitätsentwicklung von Maus, Huhn, Kaninchen und Zebrabärbling beschrieben. In dieser Arbeit wurde die Rolle der FGF-Signalaktivität für die Lateralitätsentwicklung von Xenopus laevis untersucht. Durch systemische Anwendung eines Rezeptorantagonisten in verschiedenen Entwicklungsstadien war es möglich, zwei zeitlich unterschiedliche Funktionen von FGF zu dokumentieren. Zum einen wird der FGF-Signalweg in den frühen Gastrulastadien für die Expression von FoxJ1 benötigt, dem Masterkontrollgen für motile Cilien, und somit für die Ciliogenese des symmetriebrechenden Epithels des Krallenfrosches, der GRP („gastrocoel roof plate“). Zum anderen wirkt der FGF-Signalweg auf die bilaterale Expression von Nodal. Durch deskriptive und funktionelle Untersuchung konnte gezeigt werden, dass die Nodal-exprimierenden Zellen den somitischen Anteil der GRP darstellen und ihre Entstehung durch FGF-Funktionsverlust verhindert wird. Interessanterweise steht der frühe Effekt von FGF auf die Ciliogenese im Einklang mit der beschriebenen Rolle im Zebrabärbling, während der spätere Effekt der Inhibition, der Verlust der bilateralen Nodal-Domäne, bereits in der hypomorphen Fgf8 Mausmutanten beschrieben wurde. Die Beschreibung von zwei zeitlich getrennten Funktionen in Xenopus zeigt somit, dass der FGF-Signalweg eine stärkere Konservierung aufweisen könnte als bislang angenommen. Der FGF-Signalweg teilt sich in verschiedene Zweige auf, von denen zwei in der frühen Embryonalentwicklung von Xenopus eine wichtige Rolle spielen. Hierbei wird über die FGF-abhängige MAPK-Aktivierung die Induktion des Mesoderms gewährleistet, während der PLC/PKC/Calcium-Signalweg Einfluss auf morphogenetische Veränderungen nimmt. Die FGF-vermittelte Wirkung auf die Expression von FoxJ1 stand dabei in einem zeitlichen Zusammenhang mit der Aktivität des FGF-Signalweges in der Spezifizierung des Mesoderms. Somit hatte die Rezeptor-vermittelte FGF-Inhibition in frühen Gastrulastadien starke Defizite in der Expression mesodermaler Markergene und, damit einhergehend, Blastoporusschlussdefekte zur Folge. Dies konnte durch Inhibition in späteren Gastrulastadien, in denen die Induktion des Mesoderms als weitestgehend abgeschlossen gilt und in denen der FGF-Signalweg auf die lateralen GRP-Zellen wirkt, vermieden werden. Um aufzuklären, welche der beiden intrazellulären Signaltransduktionskaskaden für die beobachteten Phänotypen verantwortlich waren, wurde der FGF-abhängige PLC/PKC/Calcium-Signalweg durch den intrazellulären Antagonisten Sprouty1 inhibiert. Sprouty1-Funktionsgewinnexperimente zeigten keinen negativen Einfluss auf die Ciliogenese, jedoch hatten sie denselben inhibierenden Effekt auf die somitischen GRP-Zellen wie die Rezeptor-vermittelte Inhibition des FGF-Signalweges. Dies deutete darauf hin, dass die FGF-abhängige Entstehung dieser Zellen durch den PLC/PKC/Calcium-Signalweg gewährleistet wird. Dass hierbei insbesondere intrazelluläres Calcium für die Bildung dieser Zellen wichtig ist, ergab sich aus Experimenten mit einem Calcium-permeablen Ionenkanal. Die frühere Funktion von FGF, die Ciliogenese, wurde dagegen unabhängig vom PLC/PKC/Calcium-Signalweg vermittelt, möglicherweise über den MAPK-Signalweg. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass der FGF-Signalweg in der Lateralitätsentwicklung von Xenopus zwei Funktionen spielt, die in Einklang mit einer konservierten Funktion dieses Signalwegs in der Lateralitätsentwicklung der Wirbeltiere stehen. Die hier gezogenen Erkenntnisse über die Wirkung des FGF-Signalwegs auf die lateralen GRP-Zellen, liefern neue Ansätze zur Untersuchung der LR-Achsendeterminierung. Als Sensorzellen des linksgerichteten Flüssigkeitsstroms spielen sie eine entscheidende Rolle in der Lateralitätsentwicklung.