Role of plasminogen activator inhibitor (PAI-1) in the pathogenesis of fructose-induced non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)

Abstract

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), a liver disease frequently associated with obesity, type 2 diabetes and dyslipidemia has become a worldwide health problem during the last decades. Results of recent studies suggest that a diet rich in fructose may also be a risk factor for the development of NAFLD. Results of our own group but also other group suggest that TNFα and PAI-1 may be involved in the development of NAFLD in rodents but also humans. Therefore, the aim of the present study was to investigate the role TNFα and PAI-1 in the onset of fructose-induced NAFLD in a mouse model as well as in human NAFLD patients. The specific aims were 1) Are TNFR1-/- mice protected from fructose-induced NAFLD? If yes, what are the molecular mechanisms involved? TNFR1 -/- and wild-type mice were either fed 30% fructose solution or tap water. Chronic fructose feeding caused a significant ~5-fold increase in triglyceride accumulation and neutrophil infiltration in livers of wild-type mice and an ~8-fold increase in plasma alanine aminotransferase (ALT) levels in comparison to control mice. Similar effects of fructose feeding were not found in TNFR 1-/- mice. Indeed, the protective effect of the tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1) deletion against the onset of fructose-induced steatosis was associated with decreased sterol regulatory element-binding protein 1 (SREBP-1), fatty acid synthase (FAS) and plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1) expression in the liver. Furthermore, the protective effect was also associated with protection against alterations markers of insulin signaling cascade (e.g. adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK), protein kinase B (Akt) levels). However, markers of hepatic lipid peroxidation, inducible nitric oxide synthase (iNOS) protein and adenosine triphosphate (ATP) levels were similar between wild-type and TNFR1 -/- mice fed fructose. Taken together, these data suggest that TNFα plays a casual role in the onset of fructose-induced liver damage as well as insulin resistance in mice through signaling cascades downstream of TNFR1. 2) Are PAI-1-/- mice protected from fructose-induced NAFLD? And if so, what are the molecular mechanisms involved? To address if PAI-1 is also a critical factor in the onset of fructose-induced NAFLD, PAI-1-/- and wild-type mice were either fed a fructose solution or tap water. Chronic fructose feeding in wild-type mice caused a marked increase in hepatic triglycerides, PAI-1 expression and plasma ALT levels in comparison to water controls. A similar effect of fructose feeding was not found in PAI-1-/- mice. PAI-1-/- mice fed fructose were protected from hepatic steatosis despite similar portal endotoxin levels, alterations of markers of insulin resistance and hepatic TNFα protein levels between fructose fed groups. The protective effect of the loss of PAI-1 against the onset of fructose-induced steatosis was associated with a significant increase in phospho-cMet, phospho Akt, expression of apolipoprotein B (ApoB) and activity of microsomal triglyceride transfer protein (MTTP) in livers of PAI-1-/- mice in comparison to fructose fed wild-type mice. Moreover, in PAI-1-/- mice expression of CD1d and markers of CD1d-reactive iNKT cells were markedly higher than in wild-type mice; however, expression of markers of activation of CD1d-reactive iNKT cells (e.g. interleukin 15 (IL-15) and interferon γ (INFγ)) were only found to be increased in livers of fructose fed PAI-1-/- mice. Taken together, these data suggest that PAI-1 plays a causal role in mediating the early phase of fructose-induced liver damage in mice through signalling cascades down-stream of Kupffer cells and TNFα. 3) Are molecular mechanisms identified in mouse studies also relevant to human situation? To determine if the alterations found in livers of animals with NAFLD are also relevant in humans with NAFLD, markers of lipid peroxidation, insulin signaling and number of iNKT cells were determined in 6 controls and 11 NAFLD patients.4-hydroxynonenal (4-HNE) protein adducts levels were significantly higher in livers of NAFLD patients whereas expression of insulin receptor substrate (IRS-1) was reduced by ~80 % in comparison to controls. PAI-1 protein levels primarily found in hepatocytes was significantly higher in NAFLD patients; however, hepatic CD1d and MTTP mRNA expression did not differ between groups. Hepatic c-Met and BCL-2l mRNA expressions were significantly lower in NAFLD patients in comparison to controls and number of CD3ζ positive cells was higher. In contrast, expression of iNKT cell markers (e.g. IL-4 and IL-15) was significantly lower in livers of patients with NAFLD when compared with controls.Taken together, the present study suggests that the molecular mechanism involved in the progression of NAFLD is similar in both rodents and humans. Furthermore, TNFα and PAI-1 may be considered as therapeutic targets for NAFLD.

Die nicht-alkoholbedingte Fettlebererkrankung (NAFLD) ist eine Lebererkrankung, die häufig mit Übergewicht, Typ-2 Diabetes und Dyslipidämie assoziiert ist und somit in den letzten Jahrzehnten zu einem weltweiten Gesundheitsproblem wurde. Ergebnisse neuer Studien legen nahe, dass eine fruktose reiche Ernährung ein Risikofaktor für die Entwicklung von NAFLD ist. Nicht nur Ergebnisse der eigenen Arbeitsgruppe, sondern auch anderer Arbeitsgruppen legen nahe, dass TNFα und PAI-1 in der Entwicklung von NAFLD in Tiermodell aber auch Menschen beteiligt sein können. Vor diese HIntergrund war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, die Rolle von TNFα und PAI-1 in der Entstehung einer fruktose-induzierten NAFLD sowohl im Mausmodell als auch bei Patienten mit NAFLD zu untersuchen. Die spezifischen Ziele waren: 1) Sind TNFR1-/- Mäuse vor der fruktose-induzierten NAFLD geschützt? Wenn ja, was sind die beteiligten molekularen Mechanismen? Tumornekrosefaktor-Rezeptor 1 (TNFR1)-/- und Wildtyp-Mäuse wurden entweder mit einer 30%igen Fruktose-Lösung oder Wasser gefüttert. Die chronische Fütterung mit Fruktose führte zu einem signifikanten, ~5-fachen Anstieg der Triglyceridkonzentration und Neutrophileninfiltration in der Leber von Wildtypmäusen, sowie einem ~8-fachen Anstieg der Konzentration der Alanin-Aminotransferase (ALT) im Plasma im Vergleich zu den Kontroll mäusen. Ähnliche Effekte konnten in TNFR1-/- Mäusen nach der Fütterung mit Fruktose nicht nachgewiesen werden. Die protektive Wirkung des Verlustes TNFR1 gegenüber der fruktose-induzierten Steatose mit einer Verminderung der Expression des sterol regulatory element-binding protein 1 (SREBP-1), der Fettsäure-Synthase (FAS) und von PAI-1 in der Leber assoziiert. Darüber hinaus waren TNFR1-/- Mäuse auch vor veränderungen von Markern der Insulin-Signalkaskade, wie der Adenosin-monophosphat-aktivierten Proteinkinase (AMPK) und der Proteinkinase B (Akt) geschützt. Jedoch fanden sich nur geringe Unterschiede in der hepatischen Lipidperoxidation, der Konzentration der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) und des Adenosintriphosphats (ATP) zwischen Wildtyp- und TNFR1-/- Mäusen nach Fruktosefütterung. Insgesamt, weisen die Ergebnisse darauf hin, dass TNFα eine wasentliche Rolle in der Entstehung von fructose-induzierte Leberschäden sowie der Insulin-Resistenz bei Mäusen über dem TNFR1 nachgeschalteten Signalkaskaden spielt. 2) Sind PAI-1-/- Mäuse vor der fruktose-induzierten NAFLD geschützt? Wenn ja, was sind die beteiligten molekularen Mechanismen? Um zu untersuchen ob PAI-1 ebenfalls ein kritischer Faktor bei der Entstehung von fruktose-induzierter NAFLD ist, wurden PAI-1-/- sowie Wildtyp-Mäuse entweder mit einer Fruktoselösung oder Wasser gefüttert. Die chronische Fütterung mit Fruktose führte in Wildtyp-Mäusen zu einem deutlichen Anstieg der Triglycerid-Konzentration in der Leber, der Expression von PAI-1 sowie der Plasma ALT-Spiegel im Vergleich zu den Wasserkontrollen. Eine ähnliche Wirkung der Fruktosefütterung auf PAI-1-/- Mäuse wurde nicht gefunden. So waren PAI-1-/- Mäuse vor der Lebersteatose trotz ähnlich hoher portaler Endotoxinspiegel, Insulinresistenz und hepatischer TNFα Konzentrationen geschützt. Die schützende Wirkung des PAI-1-Verlustes gegenüber der Entstehung von fruktose-induzierter Steatose war mit einer signifikanten Zunahme der Konzentration an phospho-c-Met, phospho Akt, der Expression von Apolipoprotein B (ApoB) sowie der Aktivität des mikrosomalen Triglyceridtransferporteins (MTTP) in den Lebern von PAI-1-/- Mäusen im Vergleich zu fruktose-gefütterten Wildtyp-Mäusen assoziert. Darüber hinaus war die Expression von CD1d und Markern von CD1d-reaktiven NKT Zellen in PAI-1-/- Mäusen deutlich höher als in den Wildtyp-Mäusen. Allerdings war die Expression der Aktivierungsmarker von CD1d-reaktiven NKT Zellen (z. B. Interleukin (IL) 15 und Interferon (IFN) γ) nur in den Lebern von fruktose-gefütterten PAI-1-/- Mäusen erhöht. Insgesamt deuten die Daten darauf hin, dass PAI-1 eine kausale Rolle in der Vermittlung der frühen Phase der fructose-induzierten Leberschädigung bei Mäusen über Signalkaskaden ?down-stream? der Kupffer-Zellen und von TNFα spielt. 3) Sind die in Mausstudien identifizierten, molekularen Mechanismen auf den Menschen übertragbar? Um festzustellen, ob die Veränderungen in der Leber von Tieren mit NAFLD auch für die Entstehung der NAFLD bei Menschen relevant sind, wurden Marker der Lipidperoxidation, Insulin-Signalkaskade und die Anzahl der iNKT-Zellen in 6 Kontrollen und 11 Patienten mit NAFLD bestimmt. Das Niveau an 4-HNE Proteinaddukten war in den Lebern der NAFLD-Patienten signifikant erhöht, wohingegen die Expression von Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS-1) im Vergleich zu den Kontrollen um ~80 % reduziert war. Die Konzentration an PAI-1 Protein war in Patienten mit NAFLD signifikant höher wohingegen die mRNA-Expression von hepatischem CD1d und MTTP sich nicht zwischen den verschiedenen Gruppen unterschied. Die Hepatische c-Met sowie die BCL-21 mRNA Expression war bei NAFLD-Patienten signifikant niedriger im Vergleich zu den Kontrollen, wohingegen die Anzahl der CD3ζ-positiven Zellen erhöht war. Im Gegensatz dazu war die Expression der iNKT-Zellmarker IL-4 und IL-15 bei Patienten mit NAFLD signifikant niedriger als in den Lebern der Kontrollen. Insgesamt deuten die Ergebinesse der vorliegende Studie darauf hin, dass die bei der Progression der NAFLD beteiligten molekularen Mechanismen sowohl bei Nagern als auch bei Menschen ähnlich sind. Ferner können TNFα und PAI-1 in der Therapie der NAFLD von Bedeutung sein.