Funktionelle Charakterisierung der Phosphatase RDGC in Drosophila melanogaster Photorezeptorzellen

Abstract

Phosphorylation of important components like rhodopsin and TRP plays a big role in the phototransduction cascade of Drosophila melanogaster. The analyzed phosphatase RDGC is needed for the dephosphorylation of both components. It is yet knwon thet RDGC is expressed in three isoforms which will be named RDGC-S, RDGC-M and RDGC-L. Nothing has been known about the origin of RDGC-M. The present work shows thet RDGC-M is generated by using an alternative translation start codon and an alternative splice site within the RNA of the short isoform. Analysis of the subcellular localization showed membrane assoziation of RDGC-M and -L whereas RDGC-S is found in the soluble fraction. Recominant expression in S2-cells identified acylation of RDGC-M and -L as the source of the membrane association. In addition, acylation of RDGC-L isolated from flies was directly proven by using a biochemical assay. To functionally characterize the three isoforms, mutant flies with different RDGC expression paterns were created and analyzed. As a result, it was shown that rhodopsin hyperphosphorylation that is found in the rdgc nullmutant as well as the associated retinal degeneration is prevented by the expression of any RDGC isoform. Regarding TRP channel phosphorylation none of the three isoforms is mandatory for the dephosphorylation of TRP at Ser936. However, the results revealed thet the total amount of RDGC that is available, in particular RDGC-M, affects the kinetics of the TRP-S936 dephosphorylation. An increased expression of RDGC-M in the absence of RDGC-S leads to a faster dephosphorylation of TRP-S936. Such a change in TRP-S936 dephosphorylation kinetics was not observed in flies overexpressing RDGC-S in an rdgc-nullmutangt backgroundand therefore cannot be attributed to the increased amount of the corresponding protein. Taken together this study shows thet the tgree RDGC isoforms differ in their subcellular localization due to differences in the N-termini. This may be the reason for kinetic differences in the dephosphorylation of TRP-S936 by RDGC-S or RDGC-M. Apart from these findings, all RDGC isoforms are able to dephosphorylate rhodopsin.

In der Phototransduktionskaskade in Drosophila spielt die Phosphorylierung wichtiger Komponenten wie Rhodopsin und TRP eine große regulatorische Rolle. Die untersuchte Phosphatase RDGC ist an der Dephosphorylierung dieser beiden Komponenten beteiligt. Es ist bereits bekannt, dass RDGC in drei Isoformen exprimiert wird, die im Folgenden als RDGC-S, RDGC-M und RDGC-L bezeichnet werden. Der Ursprund von RDGC-M war bislang nicht geklärt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass RDGC-M durch die Nutzung eines alternativen Translations-Startcodons und alternativem Spleißen aus der RNA der kürzeren Isoform entsteht. Die Untersuchung der subzellulären Lokalisation zeigte eine Membranassoziation von RDGC-M und -L, während sich RDGC-S sich in der löslichen Fraktion zeigte. Über die rekombinante Expression in S2-Zellen konnte eine Acylierung von RDGC-M und-L als Ursache für die Membranassoziation gefunden werden. Diese wurde für RDGC-L zusätzlich in einem biochemischen Assay nachgewiesen werde. Zur funktionalen Charakterisierung der Isoformen wurden entsprechende mutante Fliegen mit unterschiedlichen Expressionsmustern hergestellt und untersucht. Es wurde gezeigt, dass eine Hyperphosphorylierung von Rhodopsin, wie sie in der rdgC-Nullmutante gefunden wird, auch dann verhindert wird, wenn nicht alle Isoformen exprimiert werden. Gleiches gilt für die damit einhergehenden retinale Degeneration der Photorezeptorzellen. Untersuchungen der Dephosphorylierung von TRP zeigten, dass keine der drei Isoformen essentiell für die Dephosphorylierung von TRP ist, wohingegen der Gesamtgehalt an RDGC eine entscheidende Rolle spielt. Eine erhöhte Expression von RDGC-M in Anwesenheit von RDGC-S führt zu einer schnelleren Dephosphorylierung von TRP an der Stelle Ser936. Einen solche Änderung der Kinetik konnte in einer Fliege mit überexprimiertem RDGC-S nicht gezeigt werden und war daher nicht auf die erhöhte Menge des entsprechenden Proteins zurückzuführen. Zusammengefasst konnte gezeigt werden, dass die drei RDGC-Isoformen eine unterschiedliche subzelluläre Lokalisation aufweisen, die auf Unterschied im N-Terminus zurückzuführen sind. Dies ist möglicherweise der Grund für die unterschiedliche Geschwindigkeit der Dephosphorylierung von TRP-pS936 durch RDGC-S und RDGC-M. Zudem sind alle drei Isoformen in der Lage, Rhodopsin zu dephosphorylieren.