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Doctoral Thesis
2025

Analyse viraler Promotoren von Phycodnaviren und deren Interaktion mit Transkriptionsfaktoren

Abstract (German)

Acanthocystis turfacea Chlorella Virus 1 (ATCV-1) ist ein dsDNA-Virus aus der Gattung Chloroviren, welches Chlorella heliozoae infiziert. Das Virus besitzt 860 offene Leserahmen (open reading frames, ORF), die für die Gene codieren, die für einen korrekten Virusreplikationszyklus benötigt werden. Diese Gene werden in sehr frühe/frühe/späte Gene eingeteilt. Diese Einteilung basiert auf den Zeitpunkten der Expression der Gene. Für die Expression dieser Gene nutzt ATCV-1 virale Promotoren, die eine Mischung aus eukaryotischen und prokaryotischen Bestandteilen darstellen. Die erfolgreiche Initialisierung des Replikationszyklus mit Hilfe von sehr frühen und frühen Genen ist essenziell für eine vollständige Virusreplikation. In früheren Arbeiten konnten Gene in Paramecium busaria Chlorella Virus 1 (PBCV-1) identifiziert werden, die als sehr frühe Gene klassifiziert wurden. Das Ziel dieser Arbeit beinhaltet die Untersuchung sehr früher/ früher Gene und deren Promotoren. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Interaktion von Proteinen, deren Promotor ein Hex-Motiv (XXXCGTGG) enthalten, mit verschiedenen Faktoren untersucht werden. Basierend auf Sequenzvergleich-Analysen zwischen den sehr frühen Genen aus PBCV-1 und den Genen aus ATCV-1 wurden 20 Gene identifiziert. Die Promotoren dieser Gene wurden auf ihre Motive analysiert. Mit Hilfe einer RT-qPCR konnte gezeigt werden, dass diese Gene in der sehr frühen Phase der Virusreplikation (5 min p.i.) alle aktiv waren. Die Analyse in Pflanzen konnte zeigen, dass das Hex-Motiv in Verbindung mit mindestens einer TATA-Box ideal für die Expression der frühen Promotoren ist. Weitere Analysen konnten zeigen, dass für eine generelle Expression in Pflanzen mindestens zwei TATA-Box-Motiv in Verbindung mit anderen Motiven existieren müssen. In HEK293-Zellen konnte für die Promotoren mit dem Hex-Motiv ebenfalls eine Aktivität demonstriert werden. In der Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Arg7-ASL-System zur Untersuchung der Aktivität von viralen Promotoren genutzt werden konnte. Alle frühen Promotoren zeigten eine Aktivität in Chlamydomonas reinhardtii, inklusive Promotoren anderer Viren. Promotoren mit dem Hex-Motiv zeigten, im Vergleich zu Promotoren ohne dieses Motiv, eine Interaktion mit einer Vielzahl von unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren, die zu den bZIP-Transkriptionsfaktoren gezählt werden. Mit Hilfe zweier Proteine, Z174L und Z765R, deren Promotoren das Hex-Motiv besitzen, konnten mehrere mögliche Interaktionspartner mit Hilfe von „proximity based labeling“, darunter Proteine wie z.B. Actin, Thioredoxin und ein Histon-Acetlytransferase-Protein, identifiziert werden. Diese Proteine können mit der Transkription in Verbindung gebracht werden, was die vermutete Funktion von Z765R als Transkriptionsfaktor stützt. Z174L ist vermutlich ein Transkriptionsfaktor bzw. eine Endonuklease. Auch hierfür konnten Proteine, die diese Hypothese unterstützen, mit Hilfe der Massenspektrometrie identifiziert werden. In dem dritten Teil der Arbeit konnte mit Hilfe von Yeast-1-Hybrid-Analysen und dem Promotor von Z063L ein neues Protein, Activating protein 63 (Ap63), in Chlamydomonas reinhardtii identifiziert werden. Dieses Protein besitzt Motive, die mit DNA-Bindung in Verbindung gebracht werden. Kombiniert mit Analysen der Sequenz, handelt es sich bei dem hier entdeckten Protein vermutlich um einen Transkriptionsfaktor. Das Gesamtbild dieser Studie zeigt auf, wie abhängig das Virus von seinem Wirt für eine erfolgreiche Replikation ist und wie breit das Spektrum der Virus-Wirt-Interaktion ist. Die sehr frühe Genexpression (5 min p.i.) spielt eine essenzielle Rolle für die Replikation. Hierfür macht sich das Virus Proteine (vor allem Transkriptionsfaktoren) des Wirts zunutze, um die gesamte Genexpression der Wirtszelle auf die Virusreplikation umzuprogrammieren.

Abstract (German)

Acanthocystis turfacea Chlorella Virus 1 (ATCV-1) is a dsDNA virus belonging to the genus Chlorovirus that infects Chlorella heliozoae. The virus possesses 860 open reading frames (ORFs) encoding genes essential for a successful viral replication cycle. These genes are categorized into very early, early, and late genes based on the timing of their expression. ATCV-1 utilizes viral promoters, a mixture of eukaryotic and prokaryotic components, to drive gene expression. As in eukaryotes and prokaryotes, gene expression can be influenced by transcription factors. The successful initiation of the replication cycle with the help of very early and early genes is essential for complete viral replication. Previous studies have identified genes in Paramecium busaria Chlorella Virus 1 (PBCV-1) which were classified as very early genes. The aim of this study was to investigate very early and early genes and their expression pattern. The second part of the study focused on the interaction of genes containing a Hex motif (XXXCGTGG) in their promoter with various factors. Based on homology analyses between the very early genes from PBCV-1 and the genes from ATCV-1, 20 genes were identified. The promoters of these genes were analysed for their motifs, and using RT-qPCR, it was shown that all these genes were active in the very early phase of viral replication (5 min p.i.). Analysis in plants showed that the Hex motif in conjunction with at least one TATA box is ideal for the expression of early promoters. Further analyses showed that for general expression in plants, at least two TATA box motifs in conjunction with other motifs must exist. Activity was also demonstrated for promoters with the Hex motif in HEK293 cells. This work showed, that the Arg7-ASL system could be used to investigate the activity of viral promoters. All very early promoters showed activity in Chlamydomonas reinhardtii, including promotors from different viruses. Promoters with the Hex motif showed an interaction with a variety of different transcription factors belonging to the bZIP transcription factor family, compared to promoters without this motif. Using two proteins, Z174L and Z765R, whose promoters possess the Hex motif, several possible interaction partners, including proteins such as actin, thioredoxin, and a histone acetyltransferase, were identified using “proximity-based labelling”. These proteins can be linked to transcription, which supports the suspected function of Z765R as a transcription factor. Z174L is likely a transcription factor or an endonuclease. Proteins supporting this were also identified using mass spectrometry. In the third part of this study, a new protein, Activating protein 63 (Ap63), was identified in Chlamydomonas reinhardtii using yeast-1-hybrid analyses utilising the promotor of Z063L. This protein possesses motifs associated with DNA binding. Combined with sequence analyses, the protein identified here is likely a transcription factor. The overall picture of this study shows how dependent the virus is on its host for successful replication and how broad the spectrum of virus-host interaction is. Very early gene expression (5 min p.i.) plays an essential role in replication. The virus utilizes host proteins (especially transcription factors) for this purpose to reprogram the entire gene expression of the host cell for viral replication.

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Faculty of Natural Sciences

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Institute of Biology

Examination date

2025-04-28

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German

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Classification (DDC)

570 Biology

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@phdthesis{Benjamin Wahl2025, url = {https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/17740}, author = {Benjamin Wahl}, title = {Analyse viraler Promotoren von Phycodnaviren und deren Interaktion mit Transkriptionsfaktoren}, year = {2025}, }

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