Entwicklung und Validierung schneller und selektiver Verfahren zum Nachweis von Salmonella enterica, Cronobacter spp. und Bacillus cereus in Milcherzeugnissen

Abstract

The presence of pathogens is a serious problem in the food industry and contaminations of food with Bacillus cereus, Cronobacter spp. and Salmonella enterica are responsible for a large number of diseases worldwide. Milk products like milk, whey or cream powder are widely used in industry as an ingredient in other foods. Therefore it requires a fast and reliable identification of pathogenic microorganisms. The official methods according to § 64 LFGB or ISO/TS 22964 apply a common scheme of pre-enrichment, selective enrichment, detection and confirmation and take between three and six days. The aim of this work was the development and validation of a real-time PCR based method, which identifies the existence of the three pathogens in dairy products within 24 hours. The identification of B. cereus, Cronobacter spp. and S. enterica with the developed TaqMan real-time PCR was performed using specific genetic characteristics and an internal amplification control to eliminate false negative results. For B. cereus, the groEL gene, which codes for a heat shock protein, was selected as target. For the detection of Cronobacter spp. the ompA gene and for S. enterica the invA gene was chosen. Both genes are responsible for the invasion of the pathogens in the human epithelial cells. The adaptation of the method to the food matrix and an optimization of the enrichment time were affected by an artificial contamination of various dry dairy products. It was possible to detect 105 cfu/g C. sakazakii and S. Enteritidis cells with an initial concentration of 100 cfu/g in reconstituted powdered infant formula after enrichment of six hours. To simulate a natural contamination, powdered infant formula was contaminated with desiccated C. sakazakii cells in various concentrations and analyzed with the developed real-time PCR method. It was possible to detect an inoculum concentration of 0.01 CFU/g dry stressed C. sakazakii cells at low aw values (0.22). The new TaqMan real-time PCR is fast, reliable and specific for the clearly detection of the three major pathogenic microorganisms in milk products and was carried out within 24 hours.

Kontaminationen von Lebensmitteln mit Bacillus cereus, Cronobacter spp. und Salmonella enterica sind weltweit für eine große Zahl an Erkrankungen verantwortlich. Daher werden bei Lebensmitteln hohe Ansprüche auf Hygiene und Qualität gelegt. Häufig betroffen sind Milcherzeugnisse, da diese wie z.B. Milch-, Molke- oder Sahnepulver oft als Zutat für andere Lebensmittel verwendet werden. Diese Produkte sollten jedoch generell frei von Krankheitserregern sein, um dadurch die Produktsicherheit erhöhen zu können. Es wird daher eine spezifische, zuverlässige und schnelle Identifizierung der drei pathogenen Mikroorganismen verlangt. In der Regel dauern die bisherigen verwendeten kulturellen Standardverfahren (§ 64 LFGB, ISO/TS 22964) zwischen drei und sechs Tagen. Eine Zeitersparnis zeigen dagegen molekularbiologische Verfahren, wie die Polymerase Kettenreaktion (PCR), besonders die Real-Time PCR liefert einen schnellen und direkten Nachweis der Erreger. Das Ziel der vorliegenden Arbeit lag daher in der Entwicklung und Validierung eines molekularbiologischen Verfahrens zum Nachweis von B. cereus, Cronobacter spp. und S. enterica. Eine Diagnose, ob die Lebensmittelprobe den Erreger enthält oder nicht soll innerhalb von 24 Stunden erfolgen. Die Identifizierung der drei Zielorganismen mittels der entwickelten TaqMan Real-Time PCR erfolgte anhand spezifischer genetischer Charakteristika und unter Verwendung einer internen Amplifikationskontrolle, um falsch positive Ergebnisse ausschließen zu können. Für B. cereus wurde das groEL Gen, das für ein Hitzeschockprotein kodiert ausgewählt. Für den Nachweis von Cronobacter spp. diente das ompA Gen und für S. enterica das invA Gen. Beide Gene sind für die Invasion der beiden Pathogene in die menschlichen Epithelzellen des Gehirns und des Darms verantwortlich. Die Adaption der Verfahren an die Lebensmittelmatrix und eine Optimierung der Anreicherungszeit erfolgte mittels künstlicher Kontamination verschiedener Trockenmilchprodukte. Dabei war es möglich 105 KbE/g C. sakazakii und S. Enteritidis Zellen mit einer Anfangskeimzahl von 100 KbE/g in rekonstituierter Säuglingsnahrung nach einer Anreicherungszeit von sechs Stunden nachzuweisen. Zur Simulierung einer natürlichen Kontamination im Labormaßstab wurde pulverförmige Säuglingsnahrung mit C. sakazakii Zellen künstlich kontaminiert, getrocknet und für 4 Wochen gelagert. Mit der entwickelten TaqMan Real-Time PCR war der Nachweis einer Anfangskeimzahl von 0,01 KbE/g trocken gestresster C. sakazakii Zellen bei einem aw-Wert von 0,22 nach einer Anreicherung über Nacht möglich. Die entwickelten Real-Time PCR basierenden Verfahren für den Nachweis der drei wichtigen pathogenen Mikroorganismen in Milcherzeugnissen sind schnell, spezifisch und zuverlässig sowie innerhalb von 24 Stunden durchzuführen.