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Doctoral Thesis
2024
The Bacillus phage SPβ : a model system to study the lysis-lysogeny regulatory network and antiphage defense systems
The Bacillus phage SPβ : a model system to study the lysis-lysogeny regulatory network and antiphage defense systems
Abstract (English)
Although bacteriophages are considered the most abundant biological entities
on our planet, they are less well-studied compared to their host. Being
intracellular parasites, phages rely on the metabolic processes of their bacterial
hosts for their replication. Phages that use the host exclusively to
produce virions are called virulent phages and the reproduction cycle is
called the lytic cycle. The lytic cycle is accompanied by lysis and, thus,
the killing of the host cell. Temperate phages can choose between the virulent
or lysogenic lifecycle. Lysogeny or the lysogenic cycle is a type of viral
reproduction in which no virus particles are produced, instead, the genetic
material of the phage is replicated and then passed on to the daughter cells.
The viral genome can be present as part of the bacterial chromosome or
as a circular or linear plasmid molecule and is referred to as a prophage.
Since temperate phages can influence the mutual interactions with other
bacteria, growth, metabolic pathways or pathogenicity of their host, it is
important to understand how temperate phages control their lysogenic life
cycle and which genes are involved. Repression usually occurs through the
interaction between a repressor and specific binding sites, which are mostly
located in the promoter regions of the lytic genes.
SPβ is a temperate phage of the model bacterium Bacillus subtilis. In
contrast to its host, many aspects of the life cycle of SPβ have been little
studied and many genes have not been assigned a function. Not only are
SPβ-like phages widespread within the genus Bacillus and of greater importance
to their hosts than previously thought, but they also exhibit a
novel lysogeny management system. With regard to the control and regulation of the lysis-lysogeny network, it is already partially known which
gene products are involved in the decision, establishment and resolvement
of lysogeny. The maintenance and resolvement of lysogeny of SPβ was
investigated in more detail in this thesis. To gain more insight into the
regulation and control of lysogeny, the SPβ c2 mutant was characterized in
this work. This mutant is unable to maintain its lysogenic state when exposed
to heat, suggesting the alteration of a key regulatory element. This
work demonstrated that the SPβ c2 phenotype is due to a single nucleotide
exchange in the mrpR (yopR) gene that renders the encoded MrpRG136E
protein temperature-sensitive. Furthermore, it was shown that this protein
acts as a repressor of lytic gene expression. This occurs through the binding
of the repressor to several conserved elements in the genome of the SPβ
prophage. Further biochemical analysis revealed that the G136E exchange
makes MrpR less stable and reduces its affinity for DNA binding. Structural
characterization of MrpR revealed that the protein is a DNA-binding
protein with a similar protein fold to tyrosine recombinases. However, the
repressor function is independent of functional recombinase activity. In
addition, a mutagenesis approach was used to identify the region within
the protein that is essential for the function of the repressor. This work
also identified further players in the lysogeny management system, with
the YosL protein being crucial for the induction of the lytic cycle. However,
YosL cannot activate the lytic cycle of SPβ alone. In addition, the
core genome of SPβ-like phages was defined and new integration loci were
identified in this work.
Apart from a better understanding of lysis-lysogeny regulation and phagehost
relationships, the characterization of the SPβ c2 mutant also led to
the identification of a previously unknown phage defense system. The defense system is encoded on a plasmid and leads to a decrease in phage
titer and a change in plaque morphology. It could be shown that the spbB
locus, which ensures the segregation stability of the plasmid and codes for
two open reading frames, is also responsible for the resistance to SPβ c2
and related phages. Further studies have shown that the spbB gene and
the downstream region, which presumably encodes an RNA element and
a terminator, play a crucial role in mediating resistance. The second open
reading frame of the spbB locus is irrelevant for the mediation of phage
resistance. Overall, this work contributes to a better understanding of the
phage-host relationship.
Abstract (German)
Obwohl Bakteriophagen als die am häufigsten vorkommende biologische
Einheit auf unserem Planeten gelten, sind sie im Vergleich zu ihrem Wirt
weniger gut erforscht. Als intrazelluläre Parasiten sind Phagen für ihre Vermehrung
auf die Stoffwechselprozesse ihrer bakteriellen Wirte angewiesen.
Phagen, die den Wirt ausschließlich dazu nutzen, Virionen zu produzieren,
werden als virulente Phagen bezeichnet und der Reproduktionszyklus als
lytischer Zyklus. Der lytische Zyklus geht mit der Lyse und damit dem Tod
der Wirtszelle einher. Temperente Phagen können zwischen dem virulenten
und dem lysogenen Lebenszyklus wechseln. Die Lysogenie beziehungsweise
der lysogene Zyklus ist eine Art der viralen Reproduktion, bei der keine
Viruspartikel produziert werden, sondern nur das genetische Material des
Phagens repliziert und dann entsprechend an die Tochterzellen weitergegeben
wird. Das virale Genom kann als Teil des bakteriellen Chromosoms
oder als zirkuläres oder lineares Plasmidmolekül vorliegen und wird als Prophage
bezeichnet. Da temperente Phagen die wechselseitigen Interaktionen
mit anderen Bakterien, das Wachstum, Stoffwechselwege oder die Pathogenität
ihres Wirtes beeinflussen können, ist es wichtig zu verstehen, wie
temperente Phagen ihren lysogenen Lebenszyklus steuern und welche Gene
daran beteiligt sind. Der lysogene Zyklus durchläuft verschiedene Phasen:
Entscheidung, Etablierung, Aufrechterhaltung und Auflösung. Der lysogene
Zustand eines Prophagen wird durch die Repression lytischer Gene
aufrechterhalten. Die Repression erfolgt in der Regel durch die Wechselwirkung
zwischen einem Repressor und spezifischen Bindestellen, welche
sich in den Promoter-Bereichen der lytischen Gene befinden.
SPβ ist ein temperenter Phage des Modellbakteriums Bacillus subtilis. Im
Gegensatz zu seinem Wirt wurden viele Aspekte des Lebenszyklus von
SPβ wenig untersucht und vielen Genen konnte noch keine Funktion zugeordnet
werden. SPβ-ähnliche Phagen sind nicht nur innerhalb der Gattung
Bacillus weit verbreitet und für ihre Wirte von größerer Bedeutung
als bisher angenommen, sondern besitzen auch ein neuartiges Lysogenie-
Management-System. Im Hinblick auf die Steuerung und Regulation des
Lysis-Lysogenie-Netzwerks ist bereits teilweise bekannt, welche Genprodukte
an der Entscheidung, Etablierung und Auflösung der Lysogenie beteiligt
sind. Die Aufrechterhaltung und Auflösung der Lysogenie von SPβ
wurde in dieser Arbeit näher betrachtet und untersucht. Um mehr Einblicke
in die Regulation und Steuerung der Lysogenie zu erhalten, wurde
in dieser Arbeit SPβ c2-Mutante untersucht und charakterisiert. Diese
Mutante kann ihren lysogenen Zustand bei Hitzeeinwirkung nicht aufrechterhalten,
was auf die Veränderung eines zentralen regulatorischen Elements
schließen lässt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden,
dass der SPβ c2-Phänotyp auf einen einzelnen Nukleotidaustausch im mrpR
(yopR)-Gen zurückzuführen ist, der das kodierte MrpRG136E-Protein
temperaturempfindlich macht. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass dieses
Protein als Repressor der lytischen Genexpression fungiert. Dies geschieht
durch die Bindung des Repressors an mehrere konservierte Elemente im
Genom des SPβ-Prophagen. Weiterführende biochemische Analysen ergaben,
dass der G136E-Austausch das MrpR-Protein weniger stabil macht
und seine Affinität zur DNA verringert. Die strukturelle Charakterisierung
von MrpR ergab, dass das Protein ein DNA-bindendes Protein ist und eine
ähnliche Proteinfaltung wie Tyrosin-Rekombinasen aufweist. Allerdings ist
die Repressorfunktion unabhängig von einer funktionellen Rekombinase-
Aktivität. Zusätzlich konnte mit der Hilfe eines Mutageneseansatzes die Region innerhalb des Proteins identifiziert werden, die für die Funktion
des Repressors wesentlich ist. In dieser Arbeit konnten zudem weitere Akteure
des Lysogenie-Management-Systems identifiziert werden, wobei das
YosL-Protein für die Induktion des lytischen Zyklus entscheidend ist. Das
Protein allein kann jedoch den lytischen Zyklus von SPβ nicht aktivieren.
Zusätzlich wurde in dieser Arbeit das Kerngenom der SPβ-ähnlichen Phagen
definiert, sowie neue Integrationsloci gefunden, was zu einem besseren
Verständnis der Phagen-Wirt-Beziehung beiträgt.
Neben einem besseren Verständnis der Lysis-Lysogenie-Regulation und
der Phagen-Wirts-Bezie-hungen führte die Charakterisierung der SPβ c2-
Mutante auch zur Identifizierung eines bisher unbekannten Phagenabwehrsystems.
Das Abwehrsystem ist auf einem Plasmid kodiert und führt zur
Absenkung des Phagen-Titers und zu einer Veränderung der Plaque-Morphologie.
Es konnte gezeigt werden, dass der spbB-Lokus, welcher die Segregationsstabilität
des Plasmids gewährleistet und für zwei offene Leserahmen
codiert, ebenfalls für die Resistenz gegen SPβ c2 und verwandte Phagen
verantwortlich ist. Weiterführende Untersuchungen haben gezeigt, dass das
spbB-Gen und die stromabwärts liegende Region, welche vermutlich für
ein RNA-Element und einen Terminator kodiert, eine entscheidende Rolle
bei der Resistenzvermittlung spielen. Der zweite offene Leserahmen des
spbB-Lokus ist für die Vermittlung der Phagenresistenz ohne Bedeutung.
Insgesamt trägt die Arbeit zu einem besseren Verständnis der Phagen-
Wirt-Beziehung bei.
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Notes
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Faculty of Natural Sciences
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Institute of Biology
Examination date
2024-07-25
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English
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Classification (DDC)
570 Biology
Collections
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Standardized keywords (GND)
Sustainable Development Goals
BibTeX
@phdthesis{Kohm2024,
url = {https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/16061},
author = {Kohm, Katharina},
title = {The Bacillus phage SPβ: A model system to study the lysis-lysogeny regulatory network and antiphage defense systems},
year = {2024},
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