Die kleine GTPase RagA und der potentielle Pankreastumormarker TCTP, zwei Bindungspartner des Kerntransport-Proteins RanBP3

Abstract

RanBP3 is a component of the Crm1-mediated protein export from the nucleus. It favors the binding of export substrate to the RanGTP-Crm1 complex in the nucleoplasm. Upon translocation through the nuclear pore into the cytoplasm, the export complex is dissociated by RanBP1 and RanGAP. It was the objective of this thesis to advance the understanding of RanBP3 function by identifying novel binding partners. Using Yeast-Two-Hybrid Screening, two new interactors of nuclear protein RanBP3 were found, the small GTPase RagA and the translationally controlled tumour protein (TCTP). As a minimal requirement a short C-terminal part of RagA (residues 275-313) binds to the N-terminal region of RanBP3. Full length recombinant RagA was expressed. To substantiate the two-hybrid interactions, the binding of RagA to RanBP3 was verified by in vitro binding assays using recombinant proteins. RagA competes with exportin Crm1 for binding to RanBP3. Likewise, the nucleotide exchange factor for Ran, RCC1, binds to the RanBP3-Ran complex and inhibits RagA binding. Expression of GFP-fusion proteins established the cellular localisation of RagA in living and fixed cells. It is found predominantly in and at the nucleus. A model of RagA-import and -export is suggested. Residues 100-172 in the C-terminal part of TCTP form the binding site for its interaction with RanBP3. Using Northern Blot analysis, two mRNAs of TCTP were found in all human tissues examined. The TCTP sequence was completed using an ovarian cDNA library and the TCTP was cloned and expressed. By means of quantitative PCR it was shown that TCTP belongs to the small group of very abundant mRNA molecules in the cell. The TCTP-RanBP3 interaction was verified by in vitro binding assays using recombinant proteins. A polyclonal antibody to TCTP was generated. By using a GFP-TCTP fusion protein and anti-TCTP antibody the cellular localisation of TCTP was analysed. In Cos7-cells TCTP is found in and around the nucleus. In human cell lines most of the TCTP is localised at the nuclear membrane. Using specific anti-TCTP antibody it was shown that the TCTP level is increased in pancreatic tumours. A differential diagnosis of pancreatitis and pancreas tumour is feasible. TCTP has the potential to become a pancreatic tumour marker or a prognostic factor for ductal type adenocarcinomas of the exocrine pancreas.

RanBP3 ist eine Komponente des Crm1-vermittelten Proteinexports aus dem Zellkern. Seine Bindung verstärkt die Affinität des Crm1?RanBP3-Komplexes zu RanGTP und dem nukleären Transportgut. Nach der Translokation durch die Poren in das Zytoplasma zerfällt dieser Vierkomponenten-Komplex durch die gemeinsame Wirkung von RanBP1 und RanGAP. Ziel dieser Arbeit war es, durch Identifizierung neuer Bindungspartner das Kerntransport-Protein RanBP3 besser in etablierte Transportwege einzugliedern. Durch eine Zwei-Hybrid-Analyse wurden zwei neue Bindungspartner von RanBP3 identifiziert: die kleine GTPase RagA und das translational kontrollierte Tumorprotein (TCTP). Für die Bindung von RagA an RanBP3 sind ein kurzer carboxyterminaler Teil des RagA und der N-terminale Teil von RanBP3 ausreichend. Rekombinantes RagA wurde exprimiert. Durch in vitro Bindungs-Untersuchungen wurde die Interaktion zwischen RagA und RanBP3 bestätigt. Es wurde eine konkurrierende Bindung an den C-terminalen Teil des RanBP3 zwischen dem Exportin Crm1 und RagA gezeigt. Auch die Bindung des Guaninnukleotid-Austauschfaktors RCC1 an den RanBP3-Ran-Komplex verhindert die RagA-Bindung. Die intrazelluläre Lokalisation des RagA wurde mit Hilfe eines GFP-Fusionsproteins untersucht. GFP-RagA befindet sich vorwiegend im Kern und in Kernnähe. Ein Modell für den RagA-Import und -Export wurde vorgeschlagen. Die C-terminalen Aminosäurereste 100-172 von TCTP formen die Bindungsstelle von TCTP für RanBP3. Durch Northern-Blot-Analyse wurde gezeigt, daß TCTP in allen untersuchten Geweben in zwei mRNAs transkribiert wird. Das aus einer ovarialen cDNA-Bibliothek vervollständigte TCTP wurde kloniert und exprimiert. Mittels qPCR wurde gezeigt, daß die TCTP-mRNA zu der kleinen Gruppe mit sehr großer Kopienzahl pro Zelle gehört. Die Interaktion zwischen TCTP und RanBP3 wurde durch in vitro Bindung bestätigt. Es wurden polyklonale Antikörper gegen rekombinantes TCTP hergestellt. Die intrazelluläre Lokalisation wurde in indirekten Immunfluoreszenzstudien untersucht. In Cos7-Zellen befindet sich TCTP im Kern und der Kernumgebung. In humanen Zelllinien zeigte sich TCTP am stärksten in einem Bereich nahe der Kernmembran. Es wurde gezeigt, daß der TCTP-Spiegel in Pankreas-Tumoren erhöht ist. Auch eine Differenzierung von Pankreatitis und Pankreastumoren ist nach diesen Ergebnissen möglich. TCTP könnte zum Pankreas-Tumormarker oder zum Prognosefaktor für das duktale Adenokarzinom des exokrinen Pankreas werden.