Funktionen N- und C-terminaler Proteindomänen für Assemblierung, subzelluläre Lokalisation und Physiologie der TRP-Ionenkanäle in Drosophila Photorezeptoren

Abstract

In the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster, the cation channels TRP and TRPL are responsible for generating the receptor potential. Previous publications have shown that the TRPL ion channel changes its subcellular localization depending on light conditions, while TRP is located in the rhabdomeres irrespective of light conditions. TRP and TRPL form tetramers. However, it is under debate in the scientific literature if TRP and TRPL form ho-momultimers only or also heteromultimers. In the present study, co-immunoprecipitations (Co-IPs) of untagged TRP or TRPL channels demonstrated that the tetrameric channels in the photoreceptors of Drosophila are composed of homomultimers exclusively. Co-IPs of eGFP-tagged TRP or TRPL channels showed that the tetramers consist of eGFP-tagged and the corresponding untagged channel subunits. To study the biochemical and physiological properties of the cytosolic N- and C-termini of TRP and TRPL, eGFP-tagged chimeric TRP/TRPL ion channels were generated and ex-pressed in the photoreceptor cells R1-R6 of Drosophila. The effect of these termini on trans-location of channels between the rhabdomere and the cell body and on ion channel assembly was studied. Studies of the subcellular localization of eGFP-tagged chimeras showed that a chimera com-posed of the transmembrane regions of TRP and both the N- and the C-terminus of TRPL displayed a light-dependent translocation behavior like TRPL. Interestingly, the translocation of this chimera was much faster than the TRPL-eGFP translocation. The exchange of either the N-terminus or the C-terminus of TRPL with the respective termini of TRP caused a locali-zation of these chimeras mainly in the cell body. This localization neither corresponded to the translocation of TRPL nor to the rhabdomeric localization of TRP. Therefore, motifs inducing light-dependent translocation of TRPL must be located in both termini and are only effective in concert. Co-IPs of the eGFP-tagged chimeras demonstrated that the C-terminus of TRPL appears to be more important than the N-terminus of TRPL. For interaction with the TRP channel the C-terminus of TRP also seems to be more important than the N-terminus. TRPL-TRPL or TRP-TRP interaction via the N-terminus could only be observed by Co-IPs in certain chimeras. In contrast to the termini, the transmembrane regions of both ion channels are not necessary for interaction. Assuming that an interaction between the eGFP-tagged chimera and endogenous channel subunits might cause a mislocalization of the endogenous subunit, immunocytochemical stu-dies were carried out. On cross sections through the eyes of dark and light adapted flies ex-pressing eGFP-tagged chimeras the localization of these eGFP-tagged channels was visua-lized by the eGFP fluorescence, while the localization of the endogenous subunits was de-termined by labeling with specific antibodies. It was found that those chimeras which show a strong interaction with the endogenous channels in Co-IPs cause a mislocalization of the corresponding endogenous channels. This thesis clarified that TRP and TRPL exclusively form homomutlimers in the photorecep-tors of Drosophila. Furthermore, it could be shown, which termini are responsible for the TRP and TRPL homomultimerization and which regions of the TRPL ion channel are necessary for TRPL translocation.

In den Photorezeptorzellen von Drosophila melanogaster sind die Kationen-Kanäle TRP und TRPL für die Erzeugung des Rezeptorpotentials verantwortlich. Es ist bekannt, dass der TRPL-Ionenkanal lichtabhängig seine subzelluläre Lokalisation verändert, während TRP so-wohl in dunkel- als auch in hell-adaptierten Augen im Rhabdomer lokalisiert ist. Des Weiteren gilt als gesichert, dass diese Ionenkanäle als Tetramere vorliegen. In der wissenschaftlichen Literatur wird jedoch kontrovers diskutiert, ob TRP und TRPL nur als Homomultimere oder auch als Heteromultimere auftreten. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels Co-Immunopräzipitationen (Co-IPs) von unmarkierten TRP- oder TRPL-Kanälen gezeigt, dass die tetrameren Kanäle in den Photore-zeptoren von Drosophila ausschließlich aus Homomultimeren bestehen. Co-IPs von eGFP-markierten TRP- oder TRPL-Kanälen zeigten, dass sich die Tetramere aus eGFP-markierten und den entsprechenden endogenen Kanaluntereinheiten zusammensetzen. Um die biochemischen und physiologischen Eigenschaften der cytosolischen N- und C-Termini von TRP und TRPL untersuchen zu können, wurden im Rahmen dieser Arbeit eGFP-markierte chimäre TRP/TRPL-Ionenkanäle konstruiert und in den Photorezeptorzellen R1-R6 von Drosophila exprimiert. Speziell wurde die Auswirkung dieser Termini auf die Translokation der Ionenkanäle zwischen Rhabdomer und Zellkörper sowie auf die Assemb-lierung der Tetramere untersucht. Untersuchungen zur Translokation eGFP-markierter Chimären zeigten, dass die Chimäre mit den TRP-Transmembranbereichen und TRPL N- sowie C-Termini eine TRPL-typische, je-doch zeitlich schnellere, Translokation durchführt. Der Austausch von einem der beiden TRPL-Termini gegen TRP bewirkte, dass die Chimären vorwiegend im Zellkörper lokalisiert waren. Diese Lokalisation entspricht weder der Translokation von TRPL noch der rhabdomerischen Lokalisation von TRP. Sequenzmotive, die die subzelluläre Lokalisation der Drosophila TRP-Kanäle bestimmen, sind daher offenbar sowohl im N- als auch im C-Terminus von TRPL lokalisiert und nur im Zusammenspiel beider Termini wirksam. Co-IPs dieser eGFP-markierten Chimären zeigten, dass für eine Interaktion mit dem TRPL-Kanal der C-Terminus von TRPL wichtiger zu sein scheint als der N-Terminus. Für die Inter-aktion mit dem TRP-Kanal scheint ebenfalls der C-Terminus von TRP wichtiger zu sein als der N-Terminus. Für beide Fälle konnte in einer Chimäre aber auch eine Co-IP von TRPL bzw. TRP über den N-Terminus beobachtet werden. Im Gegensatz zu den Termini werden die Transmembranbereiche beider Kanäle für eine Interaktion nicht benötigt. Unter der Annahme, dass eine Interaktion zwischen einer eGFP-markierten Chimäre und einer endogenen Kanaluntereinheit eine Fehllokalisation dieser endogenen Kanaleinheit ver-ursachen könnte, wurden immuncytochemische Querschnitte durch die Augen dunkel- und hell-adaptierter Fliegen angefertigt. Die Lokalisation der eGFP-markierten Chimären wurde mit Hilfe der eGFP-Fluoreszenz bestimmt, während die Lokalisation der endogenen Kanäle durch spezifische Antikörper-Markierungen ermittelt wurde. Es zeigte sich, dass diejenigen Chimären, die eine starke Interaktion mit den endogenen Kanaluntereinheiten in den Co-IPs zeigen, eine Fehllokalisation der jeweiligen endogenen Kanäle verursachen. Diese Arbeit klärte auf, dass TRP und TRPL in den Photorezeptoren von Drosophila aus-schließlich Homomultimere bilden. Darüber hinaus wurde deutlich, über welche Termini von TRP und TRPL die Homomultimerisierung erfolgt. Des Weiteren wurden Bereiche des TRPLs identifiziert, welche für die TRPL Translokation benötigt werden.