Improvements of the doubled haploid technology in maize

Abstract

The in vivo doubled haploid (DH) technology in maize carries many advantages over traditional line development by recurrent selfing and has played an integral role in numerous breeding programs since the early 21st century. A bottleneck in the DH technology is still the success rate of chromosome doubling treatment, which has a strong influence on the costs of DH production. Currently, only a minority (~10%) of treated D0 haploid plants result in DH lines. Improvement in the chromosome doubling step of DH production would not only make DH lines cheaper, but could also change the optimum allocation of resources in hybrid breeding. In addition, the development of treatments using alternative doubling agents to colchicine, which is toxic to humans, would improve worker safety and simplify waste disposal issues for developing countries to benefit from the DH technology. Initiating such developments is the goal of this thesis. In a first step, we evaluated anti-mitotic herbicides with different modes of action as alternatives to colchicine for reducing the toxicity of chromosome-doubling treatment and for potentially increasing the success rates. In a series of experiments, we evaluated anti-mitotic herbicides with different modes of action in different concentrations and combinations. Based on the results of the initial experiments, we chose a specific concentration of amiprophos-methyl for evaluation in combination with varying concentrations of pronamide in a further experiment. This revealed the optimal concentration of pronamide in combination with the chosen concentration of amiprophos-methyl. However, this less-toxic treatment showed slightly lower success rates and slightly higher costs per DH line as compared to the standard colchicine treatment. In a second step after evaluating anti-mitotic herbicides for seedling treatment, we evaluated gaseous treatments using nitrous oxide (N2O), an anti-mitotic gas, in varying concentrations and combinations with air and pure oxygen. In two years of evaluation, we found an N2O treatment which had similar success rates as colchicine. The major benefit of such treatment is that this gas can simply be released into the atmosphere, eliminating the difficulty of proper chemical waste disposal, which is difficult to secure in developing countries. The only requirement is a treatment chamber, in contrast to the laboratory facilities required for handling colchicine. In a third step, we evaluated the potential of spontaneous chromosome doubling (SCD) as an alternative to chemical treatment-based chromosome doubling. Although previous studies found significant genetic variation and high heritability for SCD, a classical quantitative genetic analysis, elucidating the type of gene action governing this trait, and a selection experiment for improving SCD was missing in the literature. We found a predominance of additive genetic effects compared to epistatic effects, and a large selection gain after three cycles of recurrent selection for SCD to levels far beyond those reached by standard colchicine treatment. This indicates the great potential of SCD to improve the DH technology. The approximately ten-fold increase in spontaneous chromosome doubling rate (SDR) reached in our recurrent selection experiment marks a paradigm shift in the chromosome doubling step of DH production in maize. DH production efficiency can be greatly increased by the vast improvement in SDR, and production can be further simplified to enable even higher throughput. Instead of chromosome doubling treatment, which involves much handling of seedlings, haploid seeds from germplasm with a high innate ability to produce seed set without chemical treatment can be simply seeded in the DH nursery, eliminating the most costly production steps. Thus, this thesis has provided new opportunities to increase worker safety and reduce toxic waste in DH production, and further provided a proof of concept for genetic improvement of spontaneous chromosome doubling, which has great prospects for increasing the efficiency of DH production in maize.

Die in vivo Methode zur Erzeugung von Doppelhaploiden (DH) bei Mais bietet wesentliche Vorteile gegenüber der traditionellen Produktion von reinerbigen Inzuchtlinien mittels rekurrenter Selbstung und ist mittlerweile integraler Bestandteil vieler Maisuchtprogramme in den gemäßigten Anbauzonen. In der DH-Technologie besteht jedoch ein großer Bedarf, die Erfolgsraten bei der Behandlung zur Aufdopplung des Chromosomensatzes zu steigern, da bislang nur bei einem bescheidenen Prozentsatz (~10%) behandelter haploider Keimlinge fertile D0-Pflanzen erzeugt werden können und dies substantiell die Kosten der DH-Produktion bestimmt. Verbesserungen dieses Schrittes der Produktion von DH-Linien haben neben einer Kostenersparnis auch Auswirkungen auf die optimale Allokation von Ressourcen in der Hybridzüchtung. Die Nutzung alternativer Aufdopplungsverfahren, insbesondere die Verwendung alternativer Wirkstoffe zu dem bislang üblichen hochtoxischen Colchicin, bergen erhebliche Vorteile für den Arbeitsschutz und eine einfachere Chemikalienentsorgung. Derartige Fortschritte könnten den Einsatz der DH-Technologie insbesondere in Entwicklungsländern befördern. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, diese Entwicklungen durch Suche nach alternativen Aufdoppelungsverfahren voranzutreiben. Als erster Schritt wurden in einer Versuchsreihe anti-mitotische Herbizide mit unterschiedlichen Wirkungsweisen und Konzentrationen als Alternative zu Colchicin untersucht, um einerseits die toxische Gefährdung bei der Behandlung zur Chromosomen-Aufdopplung zu reduzieren und andererseits die Erfolgsrate zu erhöhen. Basierend auf den Ergebnissen aus ersten Experimenten wurde in einem weiteren Experiment eine Konzentrationssteigerung von Pronamid in Kombination mit Amiprophos-methyl untersucht und eine optimale Applikation beider Chemikalien gefunden. Diese zeigte eine nur marginal geringere Erfolgsrate bei kaum höheren Kosten pro erzeugter DH-Linie im Vergleich zur bisherigen Standardmethode mittels Colchicin. Als zweiter Schritt wurden gasförmige Behandlungen mit Distickstoffmonoxid (N2O), einem antimitotischem Gas, in verschiedenen Konzentrationen und Kombinationen mit Luft oder reinem Sauerstoff getestet. Mittels der zweijährigen Untersuchungsreihe konnte gezeigt werden, dass Behandlung mit N2O eine ähnliche Erfolgsrate hat wie Colchicin. Der große Vorteil der Lachgasbehandlung gegenüber Colchicin besteht darin, dass das Gas nach der Nutzung in die Atmosphäre entlassen werden kann und keine aufwendige chemische Abfallentsorgung notwendig ist, was in Entwicklungsländern meist nicht garantiert werden kann. Zur Behandlung haploider Keimlinge ist lediglich ein Druckbehälter und das Gas erforderlich, jedoch anders als im Umgang mit Colchicin kein speziell ausgestattetes Labor. In einem dritten Schritt wurde die spontane Chromosomen-Aufdopplung (spontaneous chromosome doubling; SCD) als Alternative zur chemischen Behandlung untersucht. Während bisherige Arbeiten große genetische Unterschiede sowie eine hohe Heritabilität für SCD fanden, fehlten bislang klassische quantitativ-genetische Untersuchungen, um die genetische Architektur von SCD zu analysieren. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass SCD vornehmlich auf additiven Geneffekten beruht und weniger auf epistatischen Effekten. In einem erstmals durchgeführten Selektionsexperiment zur Verbesserung der SCD konnte bereits nach drei Generationen rekurrenter Selektion ein erheblicher Selektionserfolg erreicht werden. Damit wurde die spontane Aufdopplungsrate (spontaneous doubling rate; SDR) auf ein Niveau gebracht, welche den Erfolg der Standardmethode basierend auf der Behandlung mit Colchicin weit übertraf. Die im Vergleich zu dem Ausgangsniveau des Zuchtmaterials um den Faktor 10 erhöhte SCD, die in unserem rekurrenten Selektionsexperiment erreicht werden konnte, markiert einen Paradigmenwechsel in einem für die DH-Technik wichtigen Schritt. Erheblich höhere SDR verbessern die Effizienz der DH-Produktion und vereinfachen diese zugleich. Denn anstatt der Behandlung von Keimlingen mit Colchicin können haploide Körner mit hoher SDR direkt im Zuchtgarten ausgesät werden und damit der arbeitsintensivste und zugleich teuerste Schritt der DH-Produktion umgangen werden. Insgesamt zeigt die vorliegende Arbeit verschiedene neue, erfolgsversprechende Möglichkeiten auf, um den obligatorischen Schritt der Chromosomen-Aufdopplung effizienter zu gestalten und somit die DH-Produktion von reinerbigen Linien in der Maiszüchtung zu verbessern.