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Doctoral Thesis
2009
Untersuchungen des Einflusses von Chemotherapie auf Tumor-assoziierte Fibroblasten bei Karzinomen der Lunge und Brust in vivo und in verschiedenen ex vivo Modellen
Untersuchungen des Einflusses von Chemotherapie auf Tumor-assoziierte Fibroblasten bei Karzinomen der Lunge und Brust in vivo und in verschiedenen ex vivo Modellen
Abstract (English)
Carcinomas are complex tissues in which the genetically altered epithelial tumor cells interact with their microenvironment, which plays a pivotal role in growth and survival of the whole tumor. Therefore, also the response of the tumor stroma may be important for the therapeutic success. The aim of the study was to clarify how tumor-associated fibroblasts (TAFs) respond to chemotherapy.
We established a grading system for the activity of the TAFs based on cell counts and cell morphology within neoadjuvant treated breast cancer specimens. We compared both the stromal compartment and the tumor compartment before and after therapy to evaluate the response to chemotherapy. In this in vivo study a response of the stromal compartment was detected in samples with a high stromal activity grade before chemotherapy.
To investigate the direct, more acute response of TAFs we established different ex vivo systems. On the one hand, the response to chemotherapy was tested in primary isolated TAFs from tumor tissue. On the other hand, a tissue slice culture was established to investigate the direct effect of the chemotherapy on TAFs and tumor cells within their intact microenvironment.
For the cell culture experiments freshly isolated TAFs from breast and lung tumors were used. The chemosensitivity to Cisplatinum and Paclitaxel of the primary isolated TAFs was determined and compared with a panel of established human tumor cell lines. The TAFs turned out to be resistant to Paclitaxel, whereas they showed a heterogeneous response to Cisplatinum.
One reason for this heterogeneous response to Cisplatinum could be the existence of somatic mutations and/or polymorphisms within DNA-damage response genes. Somatic mutations within the p53 tumor suppressor gene play a critical role in the response of tumor cells to chemotherapeutics. In this study, however, no somatic mutation was detected in any of the TAFs from lung. In other studies, different polymorphisms could be correlated with the sensitivity to cytotoxic stress. In this study, a non-significant trend towards the chemosensitivity of TAFs from lung carcinomas and the p53-Arg72Pro polymorphism could be observed, whereas the ERCC1-Asn118Asn und Mdm2-T/G309 polymorphisms had no influence on the chemosensitivity.
The chemosensitivity of the TAFs was also determined within their microenvironment on the basis of tissue culture experiments performed with breast and lung carcinomas. Tumor tissue slices from breast carcinomas were treated for 72 h with Paclitaxel, whereas the tissue slices from lung carcinomas were treated with Cisplatinum. To investigate the response of the different cell types to the tested chemotherapeutic drugs within the intact microenvironment, the tissue slices were fixed and stained immunhistochemically for proliferative active and dead cells. Half of the cultivated tissue slices from breast carcinomas showed a decrease in cell counts of proliferating cells, whereas half of the cases showed an increase of dead cells after the treatment with Paclitaxel in tumor and stroma cells.
The tissue slices of the lung carcinomas showed a decrease in proliferating tumor cells after Cisplatinum treatment in comparison to the untreated controls. The stroma compartment showed no proliferative activity so one could not expect a response regarding a decrease of proliferating stroma cells. Two cases showed a response to Cisplatinum regarding an increase in cell death in both cell compartments.
Short term exposure to Paclitaxel led to a parallel reaction of both tumor and stromal cells in tissue culture experiments, whereas isolated TAFs from breast tumors turned out to be resistant to Paclitaxel. In contrast, isolated TAFs from lung carcinomas are significantly more sensitive to Cisplatinum than TAFs within their intact microenvironment.
Consequently, the microenvironment of the tumor plays a crucial role in chemosensitivity. The central role of the microenvironment for response of TAFs to cytotoxic drugs is also demonstrated by the results obtained with lung cancer tissues. These observations indicate that, in addition to intrinsic factors, the microenvironment determines the sensitivity of TAFs to cytotoxic therapy.
In summary, this work demonstrates for the first time, not only the tumor cells but also the stromal cells are an important target for the chemotherapy. Intrinsic and extrinsic factors play an important role in chemosensitivity. On the one hand, the tumor microenvironment is responsible for therapy response of TAFs and on the other hand the genotype may play a crucial role in chemosensitivity. Both, tumor and stroma cells react in parallel to chemotherapy, so you can assume that both cell types are responsible for the chemosensitivity. Some therapeutic approaches could be the inhibition of either the tumor or stromal cell compartment to increase the chemosensitivity of the whole tumor.
Abstract (German)
Die Umgebung genetisch alterierter epithelialer Tumorzellen spielt eine zentrale Rolle im Wachstum und Überleben der Tumore. Für einen Therapieerfolg ist somit nicht nur die Sensitivität der malignen Tumorzellen, sondern auch die Reaktion der Stromazellen wichtig. In dieser Arbeit sollte geklärt werden, ob und wie die Tumor-assoziierten Fibroblasten (TAFs) im Tumorstroma auf Chemotherapie reagieren.
So konnte anhand von neoadjuvant behandelten Mammakarzinomen vor und nach Chemotherapie die Reaktion der TAFs auf Chemotherapie in vivo bewertet werden. Es wurde in dieser Arbeit erstmals nachgewiesen, dass es in Fällen mit einem hohen Aktivitätsgrad der TAFs vor der Therapie zu einem deutlichen Aktivitätsverlust nach Therapie kommt. Das Ansprechen der TAFs auf Chemotherapie ist unabhängig von der Reaktion der Tumorzellen.
Mit dieser in vivo Untersuchung konnte nicht geklärt werden, ob das Tumorstroma ein direktes oder indirektes Ziel der Chemotherapie ist. Daher wurden in dieser Arbeit verschiedene ex vivo Kultursysteme entwickelt, die es ermöglichen, die direkte Reaktion des Tumorstromas auf die Therapie zu beobachten.
Zum einen wurden primäre TAFs aus frischem Gewebe von Mamma- und Bronchialkarzinomen isoliert und in Einzelzellkultur die Sensitivität gegenüber Chemotherapeutika getestet. Zum anderen wurde ein Gewebekultursystem etabliert, um das direkte Therapieansprechen der TAFs und der Tumorzellen in ihrer natürlichen Gewebeumgebung zu untersuchen.
Die Chemosensitivität der primären isolierten TAFs gegenüber Cisplatin und Taxol wurde bestimmt und mit etablierten Tumorzelllinien verglichen. Die TAFs zeigten sich gegenüber Taxol sehr resistent, während sie auf Cisplatin heterogen reagierten. Auch die Entität spielt bei der Sensitivität gegenüber Chemotherapeutika eine große Rolle. Die primären, isolierten TAFs aus Mammakarzinomen waren im Vergleich zu den etablierten Tumorzelllinien relativ resistent gegenüber Cisplatin, während die TAFs aus den Bronchialkarzinomen sich gegenüber der Behandlung genauso heterogen zeigten, wie die etablierten Tumorzelllinien.
Eine mögliche Erklärung für dieses heterogene Ansprechen gegenüber Cisplatin können somatische Mutationen oder Polymorphismen innerhalb von DNA-Schadensreparatur-Genen sein. Es konnte in 28 untersuchten TAFs aus Bronchialkarzinomen keine somatische p53-Mutation detektiert werden, somit konnte ein Zusammenhang mit dem heterogenen Ansprechen gegenüber Cisplatin ausgeschlossen werden. Des Weiteren wurden die Polymorphismen p53-Arg72Pro, ERCC1-Asn118Asn und Mdm2-T/G309 untersucht. Es wurde dabei ein nicht-signifikanter Zusammenhang zwischen der Chemosensitivität der TAFs aus Bronchialkarzinomen und dem p53-Arg72Pro Polymorphismus gefunden, während die ERCC1-Asn118Asn und Mdm2-T/G309 Polymorphismen keine Rolle zu spielen scheinen.
Die Chemosensitivität der TAFs wurde innerhalb ihrer natürlichen Umgebung anhand von Frischgewebeschnitten aus Mamma- und Bronchialkarzinomen untersucht. Die Viabilität der Schnitte wurde über vier Tage Kultivierung sichergestellt und es konnte keine Veränderung der Morphologie des Gewebes während dieser Zeit beobachtet werden. Um die Wirkungen der verwendeten zytotoxischen Substanzen auf die einzelnen Zelltypen innerhalb der Frischgewebeschnitte untersuchen zu können, wurden proliferierende und tote Zellen im Tumor- und Stromabereich immunhistochemisch nachgewiesen und quantifiziert.
Die Frischgewebeschnitte der Mammakarzinome zeigten nach Taxol-Behandlung bei der Hälfte der Fälle einen Rückgang der Proliferation und einen Anstieg der Anzahl toter Zellen in beiden Zellkompartimenten. Die Frischgewebeschnitte aus Bronchialkarzinomen zeigten in neun von 16 Fällen einen Rückgang der proliferierenden Tumorzellen nach Cisplatin-Behandlung. Da das Tumorstroma hier kaum proliferierte, konnte auch kein Ansprechen auf die Behandlung erwartet werden. In den Fällen, die auf die Cisplatin-Behandlung mit Zelltod reagierten, wurde der Anstieg des Zelltods in beiden Zellkompartimenten detektiert.
Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit erstmals gezeigt, dass nicht nur die epithelialen Tumorzellen, sondern auch die TAFs ein wichtiges Ziel der Chemotherapie sind. Die Reaktion der TAFs auf die Chemotherapie ist in unterschiedlichen Entitäten, aber auch innerhalb einer Entität sehr heterogen. Zum einen spielt die Umgebung eine große Rolle beim Ansprechen des Tumorstromas und zum anderen kann davon ausgegangen werden, dass auch der Genotyp Einfluss auf die Reaktion der TAFs gegenüber Chemotherapie nimmt. Die Beobachtung, dass im nativen Tumorgewebe die Tumorzellen parallel mit den TAFs reagieren, lässt die Vermutung zu, dass beide Zelltypen für das Überleben des Tumors wichtig sind und eine Hemmung eines der Kompartimente zur Sensitivierung des anderen führen könnte.
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Faculty of Natural Sciences
Institute
Institute for Zoology
Examination date
2009-07-05
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German
Publisher
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Classification (DDC)
570 Biology
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Original object
Standardized keywords (GND)
Sustainable Development Goals
BibTeX
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