Bedeutung von Tumorantigenen bei Hauttumorpatienten

Abstract

Essential prerequisites for the development of specific immunotherapies and procedures for diagnosis and prognosis of tumor diseases are the knowledge and characterization of tumor antigens. Potential antigens for immunotherapeutic strategies and diagnosis tools should be tumor-specific. Moreover, indications for immune responses in patients e.g. antibody or T cell responses should be available. In this thesis, antibody responses of patients of cutaneous T cell lymphoma (CTCL), melanoma (MM) and controls were investigated using two different methods. In addition, the tumor antigen GAGE-7b was characterized using a rabbit polyclonal antibody. In order to test antibody frequencies of various tumor antigens in parallel, a serum antibody detection array (SADA) was established. Testing 42 tumor antigens, antibodies against 14 antigens were only detectable in patients but not in controls. Serum antibody frequencies of antigens GBP-5ta, GBP-5a, HD-MM48 and HD-MM-19 were significantly higher in MM patients compared to controls. The same was true for antigens HD-MM-48 and HD-CL-02 comparing CTCL patients and controls. In summary, antibody frequencies were relatively low ranging most frequently from 0% to 10% which limits the use of the respective antigens as diagnostic targets. An additional method to measure immunoreactivities of 13 cancer testis and tumor-associated antigens in different groups named multiplex serology was used. Antibodies against LAGE-1a were detected significantly more frequently in MM patients in comparison to controls. In addition, this higher antibody frequency in MM patients was stage dependent. For antigens MAGE-A3, GAGE-7b and se57-1 a higher antibody frequency in MM patients was measured likewise. Antibody titers of MM and CTCL patients rarely changed over time, thus seroconversions were seen only sporadically. Significantly higher reactivities could be identified for MAGE-A1 and A9 in CTCL patients of different stages compared to controls. In future, analyzing patients immunized with interferon-g, tumor or dendritic cells or immunotherapy targeting specific tumor antigens would be of high interest. For the first time, a comprehensively characterized rabbit polyclonal antibody against GAGE-7b was generated and used in Western Blot and immunohistology. In Western Blot analysis, 59% of all MM cell lines tested expressed GAGE-7b, whereas no protein was detected in both CTCL cell lines and control tissues except testis. This expression pattern was confirmed by immunocytology. Immunohistological tests confirmed that 53% of MM tissues are positive for GAGE-7b protein expression. Moreover, antibodies against GAGE-7b could be identified in 6% of MM and CTCL patients whereas controls had no detectable antibody responses. On the basis of the achieved results, the GAGE-7b antibody recognizes probably all GAGE family members. Future analysis using this antibody may permit the elucidation of functional aspects of GAGE expression in tumor diseases.

Essentielle Voraussetzungen für die Entwicklung von spezifischen Immuntherapien und Verfahren zur Diagnose und Prognose von Tumorerkrankungen sind die Kenntnis und Charakterisierung von Tumorantigenen. Potentielle Antigene für immuntherapeutische Strategien und Diagnoseverfahren sollten möglichst tumorspezifisch sein. Zudem sollten Hinweise auf bereits im Patienten induzierte Immunantworten z.B. in Form von Antikörper- oder T-Zellantworten bestehen. In dieser Arbeit wurden Antikörperantworten in Patienten des kutanen T-Zell Lymphoms (CTCL), des malignen Melanoms (MM) und von Kontrollen (Ctrl) mittels zweier methodischer Ansätze untersucht sowie das Tumorantigen GAGE-7b unter Verwendung eines in einem Kaninchen generierten polyklonalen Antikörpers charakterisiert. Um Antikörper-Häufigkeiten für zahlreiche Tumorantigene parallel zu bestimmen, wurde ein Serumantikörper-Detektionsarray (SADA) etabliert. Bei der Untersuchung von 42 Tumorantigenen wurden für 14 Antigene Antikörper nur in Patienten jedoch nicht in Ctrl detektiert. Die Serumantikörper-Häufigkeiten der Antigene GBP-5ta, GBP-5a, HD-MM-48 und HD-MM-19 im MM-Kollektiv war signifikant höher als im Kontroll-Kollektiv. Dies traf auch für die Antigene HD-MM-48 und HD-CL-02 im Vergleich von CTCL- und Kontroll-Kollektiv zu. Insgesamt waren die Antikörperantwort-Häufigkeiten mit zumeist unter 10% relativ gering, welches die Verwendung der entsprechenden Antigene als diagnostische Ziele einschränkt. Ein weiteres Verfahren zur Bestimmung der Immunreaktion von 13 Cancer-Testis- und Tumor-assoziierten Antigenen in verschiedenen Kollektiven wurde in Form der Multiplex-Serologie verwendet. In einem MM-Kollektiv wurden Antikörper gegen LAGE-1a signifikant häufiger identifiziert im Vergleich zu einem Kontroll-Kollektiv. Zusätzlich war diese höhere Antikörper-Häufigkeit in MM-Patienten stadienabhängig. Für die Antigene MAGE-A3, GAGE-7b und se57-1 wurden ebenfalls höhere Antikörper-Häufigkeiten in MM-Patienten gemessen. Antikörper- Titer von MM- und CTCL-Patienten veränderten sich über die Zeit selten, so dass Serokonversionen nur vereinzelt nachgewiesen werden konnten. Für MAGE-A1 und A9 konnten für verschiedene Stadien signifikant höhere Reaktivitäten im CTCL- im Vergleich zum Kontroll-Kollektiv ermittelt werden. Interessante Ansatzpunkte für zukünftige Analysen wären Kollektive, die mit Interferon-g, Tumor- oder dendritischen Zellen behandelt oder in Immuntherapien gegen spezifische Tumorantigene aufgenommen wurden. Erstmalig konnte ein umfassend beschriebener polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen GAGE-7b hergestellt werden, der im Western Blot und in der Immunhistologie verwendet wurde. Im Western Blot konnte nachgewiesen werden, dass 59% der untersuchten MM-Zelllinien GAGE-7b exprimierten, wohingegen kein Protein in CTCL-Zelllinien und in Kontrollgeweben mit Ausnahme von Testis detektiert werden konnte. Dieses Expressionsverhalten konnte in immunzytologischen Untersuchungen bestätigt werden. Immunhistologisch exprimierten 53% der MM-Gewebe GAGE-7b. Des Weiteren konnten in 6% der MM- und CTCL-Patienten Antikörper gegen GAGE-7b nachgewiesen werden, während keine Antikörper in Ctrl gefunden wurden. Aufgrund der erhaltenen Ergebnisse erkennt der GAGE-7b Antikörper wohl alle GAGE-Familienmitglieder. Zukünftige Untersuchungen unter Verwendung dieses Antikörpers können die Aufklärung funktioneller Aspekte der GAGE-Expression in Tumorerkrankungen ermöglichen.