Evaluation and method development for the biosynthesis of microbial lipopeptides by bacillus species

Abstract

Microbial lipopeptides are secondary metabolites produced by bacteria and single-celled microorganisms. They consist of a cyclic or linear peptide chain linked to a lipid residue. Due to their high-foaming biosurfactant properties, they have various industrial applications such as in detergents, food emulsifiers, bioremediation, and enhanced oil recovery. Additionally, they possess other functional properties such as antifungal activity, making them an environmentally friendly alternative to synthetic fertilizers and fungicides. Bacillus species produce cyclic lipopeptides known for their potent antifungal activity, which makes them a potential source of bio-fungicides in agriculture. However, the production titer of wild-type Bacillus species does not meet industrial needs. Thereby, genetic modification of producer strains and bioprocess engineering can help increase the production of lipopeptides. Nevertheless, the regulation and basis of biosynthesis for Bacillus lipopeptides are still not completely understood, and ongoing research aims to enhance their production. In general, three main lipopeptide families, including surfactins, iturins, and fengycins are produced by different Bacillus species. Among these, surfactin as the strong biosurfactant is the most extensively studied lipopeptide produced by Bacillus species. The focus of this doctoral thesis was mainly to evaluate the biosynthesis of iturin and fengycin families, which are strong antimicrobial lipopeptides produced by Bacillus subtilis and Bacillus velezensis. This involved developing strains through genetic engineering and enhancing the lipopeptide titer by evaluating the cultivation medium. Initially, the entire genome of the bacteria used in this thesis was examined in terms of lipopeptide biosynthesis, and the structure and yield of the different produced lipopeptides were analyzed. Regarding the lipopeptide producer derivatives of the domesticated laboratory model strain B. subtilis 168 and B. subtilis 3NA, a spore deficient strain appropriate for bioreactor cultivation, surfactin is the lipopeptide with the highest yield, while plipastatin which is a member of fengycin family, is produced in lower quantities. In the present thesis, the biosynthesis of plipastatin by B. subtilis BMV9 as the lipopeptide producer derivative of strain 3NA was evaluated. The study aimed to convert BMV9 to a constitutive plipastatin mono-producer strain. In this sense, overexpressing plipastatin biosynthesis operon using the stronger constitutive Pveg promoter led to a five-fold increase in plipastatin production. Interestingly, it was observed that deletion of srfAA-AD operon in BMV9 and the constructed constitutive plipastatin producer strain has not improved plipastatin production. Therefore, it can be stated that presumably the biosynthesis of plipastatin may be positively influenced in a post-transcriptional manner by the surfactin synthetase or some of its subunits. However, the regulatory mechanism behind this effect remained unknown and requires further research. Another attempt to enhance the plipastatin biosynthesis in strain BMV9 was repairing the degQ expression. One main genome characterization of strains with B. subtilis 168 and 3NA background is that the pleiotropic degQ gene expression, which is known to have a positive effect on plipastatin biosynthesis, is silenced due to a mutation in the promoter area. However, while repair of degQ expression in BMV9 increased the plipastatin production, combination of both repaired degQ expression and promoter exchange (Ppps::Pveg) has not significantly increased the plipastatin yield. To further evaluate the impact of degQ expression on surfactin and plipastatin biosynthesis, two strains of B. subtilis were selected: JABs24, a lipopeptide producer derived from the 168 strain, and DSM10T, the wild-type strain expressing native degQ. The findings demonstrated that surfactin biosynthesis is negatively affected by DegQ-associated DegU regulation, while increased plipastatin biosynthesis is achieved in the presence of native degQ expression. In addition to production of lipopeptides, the DegU regulatory system also plays a role in the formation of secretory proteases. A comparison of extracellular protease activities between JABs24 and DSM10T showed that degQ expression led to DSM10T having five times higher protease activity than JABs24. Interestingly, production of extracellular proteases has not affected the stability of both plipastatin and surfactin during cultivation, suggesting that lipopeptides are less targeted by extracellular proteases. The identification of proficient wild-type strains is critical to the advancement of bio-fungicide in agriculture. Therefore, the subsequent approach of this thesis centered on the production of microbial lipopeptide by wild-type B. velezensis strains. Here, the lipopeptide productivity and antifungal ability of B. velezensis UTB96 was higher than B. velezensis FZB42, as a well-established strain for biocontrol of plant pathogens in agriculture. Furthermore, addition of certain amino acids stimulated lipopeptide production, and using a bioreactor system resulted in enhancement of lipopeptide production, especially iturin A by UTB96. Overall, the doctoral thesis evaluates the biosynthesis of antimicrobial lipopeptides produced by B. subtilis and B. velezensis. The study involves genetic engineering such as promoter exchange, deletion of genes involved in competing biosynthetic pathways and cultivation medium development with amino acid supplementation to enhance the lipopeptide titer. The thesis also identifies B. velezensis UTB96 as a promising candidate for further research to be used as a wild-type antifungal agent in agriculture.

Mikrobielle Lipopeptide sind Sekundärmetabolite, die von Bakterien und einzelligen Mikroorganismen produziert werden. Sie bestehen aus einer zyklischen oder linearen Peptidkette, die an einen Lipidrest gebunden ist. Aufgrund der stark schäumenden Eigenschaften von Biotensiden, werden diese in der Industrie in verschiedenen Bereichen eingesetzt, wie z. B. in Reinigungsmitteln, Lebensmittele-mulgatoren, bei der Bioremediation und der verbesserten Ölgewinnung. Darüber hinaus besitzen sie weitere funktionelle Eigenschaften, wie z. B. eine antimykotische Wirkung, was sie zu einer sicheren und umweltfreundlichen Alternative zu synthetischen Düngemitteln und Pestiziden macht. Bacillus‐Arten produzieren zyklische Lipopeptide, die für ihre starke antimykotische Wirkung gegen Phytopathogene bekannt sind, was sie zu einer potenziellen Quelle für Bio‐Fungizide in der Landwirtschaft macht. Der Produktionstiter von Wildtyp‐Bacillus‐Arten entspricht jedoch nicht dem industriellen Bedarf. Durch genetische Veränderung und Bioverfahrenstechnik kann die Produktion von Lipopeptiden gesteigert werden. Dennoch sind die Regulierung und die Grundlagen der Biosynthese von Bacillus‐Lipopeptiden noch nicht vollständig geklärt, und die laufende Forschung zielt auf die Optimierung ihrer Produktion ab. Es ist bekannt, dass Bacillus‐Arten drei Hauptlipopeptidfamilien produzieren, darunter Surfactin, Iturin und Fengycin. Unter diesen ist Surfactin das am besten untersuchte Biotensid. Im Mittelpunkt dieser Doktorarbeit stand die Untersuchung der Biosynthese der Iturin- und Fengycin‐Familien. Diese stark antimikrobiellen Lipopeptide werden von Bacillus subtilis und Bacillus velezensis produziert. Dazu wurden gentechnisch modifizierte Stämme entwickelt und der Lipopeptid‐Titer durch Verbesserung des Kultivierungsmediums erhöht. Zunächst wurde das gesamte Genom der in dieser Arbeit verwendeten Bakterien im Hinblick auf die Lipopeptidbiosynthese untersucht, und die Struktur und Ausbeute der verschiedenen produzierten Lipopeptide wurden analysiert. Bei den lipopeptidproduzierenden Derivaten des domestizierten Labormodellstammes B. subtilis 168 und B. subtilis 3NA, einem für die Bioreaktorkultivierung geeigneten nicht sporulierenden Stamm, ist Surfactin das Lipopeptid mit der höchsten Ausbeute. Im Gegensatz dazu wird Plipastatin, ein Mitglied der Fengycinfamilie, in geringeren Mengen produziert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Biosynthese von Plipastatin durch B. subtilis BMV9, dem Lipopeptidproduzenten‐Derivat des Stammes 3NA, untersucht. Der Regulationsmechanismus, der diesem Effekt zugrunde liegt, ist jedoch noch unerforscht und bedarf weiterer Forschung. Ein weiterer Versuch, die Plipastatin‐ Biosynthese im Stamm BMV9 zu verbessern, war die Reparatur der degQ‐Expression. Eine wesentliche Genomcharakterisierung von Stämmen mit B. subtilis 168 und 3NA-Hintergrund besteht darin, dass die pleiotrope degQ‐Genexpression, von der bekannt ist, dass sie sich positiv auf die Plipastatinbiosynthese auswirkt, aufgrund einer Mutation im Bereich des Promotors inaktiv ist. Während jedoch die Reparatur der degQ‐Expression in BMV9 die Plipastatinproduktion erhöhte, konnte die Kombination aus reparierter degQ-Expression und Promotoraustausch (Ppps::Pveg) die Plipastatinausbeute nicht signifikant steigern. Um die Auswirkungen der degQ‐Expression auf die Surfactin‐ und Plipastatin‐Biosynthese weiter zu untersuchen, wurden zwei B. subtilis‐Stämme ausgewählt: JABs24, ein von Stamm 168 abgeleiteter Lipopeptidproduzent, und DSM10T, der Wildtyp‐Stamm, der natives degQ exprimiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Surfactin‐Biosynthese durch die DegQ‐assoziierte DegU‐Regulierung negativ beeinflusst wird, während die Plipastatin‐ Biosynthese bei Vorhandensein einer nativen DegQ‐Expression gesteigert wird. Neben der Produktion von Lipopeptiden spielt das DegU‐Regulationssystem ebenfalls eine Rolle bei der Bildung von sekretorischen Proteasen. Interessanterweise hat die Produktion von extrazellulären Proteasen die Stabilität von Plipastatin und Surfactin während der Kultivierung nicht beeinträchtigt, was darauf hindeutet, dass Lipopeptide kaum von extrazellulären Proteasen angegriffen werden. Die Identifizierung tauglicher Wildtyp‐Stämme ist für die Weiterentwicklung von Biofungiziden in der Landwirtschaft von entscheidender Bedeutung. Daher konzentrierte sich der weitere Ansatz dieser Arbeit auf die Produktion von mikrobiellen Lipopeptiden durch Wildtyp‐B. velezensis‐Stämme. Dabei waren die Lipopeptidproduktivität und die antimykotische Fähigkeit von B. velezensis UTB96 höher als die von B. velezensis FZB42, einem etablierten Stamm zur Biokontrolle von Pflanzenpathogenen in der Landwirtschaft. Außerdem stimulierte die Zugabe bestimmter Aminosäuren die Lipopeptidproduktion, und die Verwendung eines Bioreaktorsystems führte zu einer Steigerung der Lipopeptidproduktion, insbesondere von Iturin A durch UTB96. Zusammenfassend wird in der Dissertation die Biosynthese antimikrobieller Lipopeptide untersucht, die von B. subtilis und B. velezensis produziert werden. Die Studie umfasst gentechnische Eingriffe wie den Austausch von Promotoren, die Deletion von Genen, die an konkurrierenden Biosynthesewegen beteiligt sind, und die Entwicklung von Kultivierungsmedien mit Aminosäuresupplementierung zur Steigerung des Lipopeptid‐ Titers. In der Dissertation wird B. velezensis UTB96 als vielversprechender Kandidat für weitere Forschungen identifiziert, um als Wildtyp‐Antimykotikum in der Landwirtschaft eingesetzt zu werden.