Entwicklung und Testung neuer DNA- und Protein-basierter Multikomponentenvakzinen sowie regulatorischer Adjuvanzien gegen eine Infektion mit B. anthracis in Auszucht-Mäusen und Ziegen

Abstract

The discovery of the Sterne spore live vaccine (SSLV) and subsequently its application in a veterinary context contributed to the global reduction of Anthrax related outbreaks since 1930. Nonetheless the causative agent Bacillus anthracis is still prevalent in some mediterranean countries, South and Central America, Africa and Central Asia, as well as the USA and Canada. Reasons for this are the persistence of the pathogen in the soil, as well as still undefined factors for an ongoing cycle of outbreak and spread of the disease and the limited applicability of the SSLV. This includes the necessity to revaccinate annually, the residual virulence in certain sensitive species (e. g. goats and llamas) and the incompatibility to treat and vaccinate simultaneously. To participate in the ongoing search for alternative vaccines this work was dedicated to evaluate protein- and DNA-based components as potential ingredients for a multi-component non-living vaccine formulation (NLV). For the protein-based NLV these included rPA83 as part of the Anthrax toxin, rBclA and Formalin inactivated spores (FIS) as spore specific antigens, a Capsule-Lipopeptide conjugate as part of the vegetative form of the pathogen and a Lipopeptide-adjuvant. The DNA-vaccines consisted of vector-backbones comprising signal sequences able to direct the integrated antigens (rPA83, PAD4LFD1 and BclAD1D3) to the MHCI, MHCII and the secretory pathway. A sperate vector encoding for a positive MHCII-regulator (CIITA) and a vector internal sequence for the Interferon-ß promotor stimulator (mIPS1) served as adjuvants for the DNA-vaccines. The majority of the groups showed detectable antibody titres against their respective antigens, with protein vaccines generally eliciting higher titres against rPA83 than the DNA-vaccines. Regarding rBclA equivalent high titres were measured for protein- and DNA-vaccines alike, which also corresponded to the anti-FIS titres for groups immunized with rBclA, FIS or both. The Capsule-Lipopeptide conjugate did not elicit high titres against the capsule, possibly due to an immune suppressing epitope. Survival rates ranged between 10 and 100 %, with full protection only achieved in a combination of all antigens including FIS. All DNA-vectors induced 30 – 50 % protectiveness when given alone. Notably DNA-vectors including BclAD1D3 elicited 50 % survival and sterile immunity. A combination of the most promising vectors encoding for toxin and spore specific antigens achieved 90 % protectiveness in mice. According to the results from the mice trials, the auspicious protein- and DNA-vaccine combinations were tested in goats in comparison to the SSLV in cooperation with our project partners in South Africa and Turkey. The efficacy of the SSLV was assessed in 3 groups which were challenged shortly after the first immunisation, one year after the first immunisation or after the revaccination. Apart from the comparison of immunogenicity and protectiveness between SSLV and NLV in goats, assessment of data concerning the titre development of SSLV-immunized goats during the course of a year as well as detailed diagnostic data during the infection (behavior, temperature, bacterial loads, correlations and minimal infective dose) were integral part of this study. Compared to one another the SSLV-immunized animals showed equal or higher antibody titres against the measured antigens, with FIS and rPA83 being the most immunogen antigens. Utilizing a higher dose (75 µg) the protein-based NLV protected equivalently to the SSLV (60 – 100 %) yielding 50 % protectiveness without FIS and 80 % if FIS was included. The DNA-vaccines showed little to no immunogenicity in goats, thus no challenge was performed on these animals. The humoral reaction against BclA was generally poor in goats, which has not been noted before and could be a basis for further improvements concerning the SSLV and NLV alike. The different immunizations with the SSLV revealed a broad range for the efficacy of the first vaccination as well as a notable difference in the antibody spectrum between first vaccination and revaccination. Together with the recorded data of the antibody titre development throughout a year a more optimal protocol for immunisation with the SSLV, possibly in combination with an NLV was postulated.

Durch die Entdeckung und subsequenten Verwendung der Sterne Sporen Lebendvakzine (SSLV) in der Veterinärmedizin konnte die Zahl der globalen Milzbrandausbrüche seit 1930 stark reduziert werden. Dennoch sind auch heute noch Länder im mediterranen Raum, in Süd- und Zentralamerika, Afrika und Zentralasien, sowie einigen Gebieten der USA und Kanada endemisch mit Bacillus anthracis belastet. Unter anderem ist dies auf die noch immer ungeklärten Faktoren im Zyklus der wiederkehrenden Aus- und Verbreitung des Erregers und dessen Persistenz im Boden zurückzuführen. Zudem ist die Anwendbarkeit der SSLV durch die Notwendigkeit einer jährlichen Auffrischung, der Restvirulenz des Impfstammes bei einigen sensitiven Tierarten (Ziegen und Lamas) und der Unvereinbarkeit einer antibiotischen Behandlung mit einer gleichzeitigen Impfung eingeschränkt, sodass weiterhin nach alternativen Vakzinierungsmethoden geforscht wird. In dieser Arbeit wurden unter Verwendung von Vakzinen auf Protein- und DNA-Basis Möglichkeiten zur alternativen Immunisierung mit „nicht lebend Vakzinen“ (NLV) evaluiert. Zu testen waren in der Proteinstudie rPA83 als Toxinkomponente, Formalin inaktivierte Sporen (FIS) und rBclA als Sporenantigene, sowie ein Kapsel-Lipopeptid-Konjugat als Bestandteil der vegetativen Form von B. anthracis. Zur Unterstützung der Immunogenität wurde ein Lipopeptid-Adjuvans verwendet. Für die DNA-Vakzine kamen verschiedene Vektorrückgrate zum Einsatz, welche Signalsequenzen beinhalteten, die das integrierte Antigen (rPA83, PAD4LFD1 und BclAD1D3) über den MHCI, MHCII oder sekretorischen Weg dirigieren. Als Adjuvanzien wurden ein separater Vektor mit einem positiven MHCII-Regulator verwendet (CIITA) oder integriert in den Vektor des Antigens ein Interferon-ß Promotor Stimulator (mIPS1). Die aufgeführten Vakzinekomponenten wurden im Rahmen dieser Arbeit einzeln und in Kombination im NMRI-Mausmodell getestet, um eine geeignete Kombination für den Gebrauch in der Ziege auszuwählen. In Bezug auf rPA83 waren die getesteten Proteinvakzinen effektiver als die DNA-Vakzinen, welche weitaus niedrigere Titer aufwiesen. Für rBclA waren äquivalent hohe Titer bei DNA- und Proteinvakzinen messbar. Den gemessenen anti-rBclA Titern entsprechende hohe IgG Titer gegen FIS konnten in alle Gruppen nachgewiesen werden, die sowohl nur rBclA als auch FIS oder beides in Kombination erhalten hatten. Das Kapselkonjugat war wenig immunogen, was retrospektiv vermutlich auf ein immunsupprimierendes Epitop zurückzuführen war. Die Überlebensraten der getesteten Gruppen bewegten sich zwischen 10 und 100 %, wobei nur die Kombination aller Proteinvakzinen und FIS mit 100 % komplett schützte. Die DNA-Vakzinen zeigten einzeln Schutzraten von 30 – 50 %. Hervorstechend hierbei waren die getesteten Konstrukte mit rBclA, die ohne weitere Antigene mit einer Überlebensrate von 50 % die beste Schutzwirkung zeigten und zudem eine sterile Immunität aufwiesen. In Kombination mit dem besten Toxin-Vektor konnte eine Schutzrate von 90 % erreicht werden, womit DNA- und Proteinvakzine ein gleichwertiges Potential für weitere Versuche aufwiesen. Entsprechend wurden die erfolgversprechendsten Kombinationsvakzinen im Vergleich zur SSLV mit Hilfe von Kooperationspartnern in Südafrika und der Türkei in Ziegen getestet. Die schützende Wirkung der SSLV wurde in 3 Gruppen bestimmt, direkt nach der Erstimmunisierung, nach dem Verlauf von einem Jahr und direkt nach einer Auffrischungsimpfung. Neben der Gegenüberstellung der Immunogenität und Schutzwirkung der Vakzinen im Ziegenmodell waren die Beobachtungen zum Verlauf der Immunreaktion von SSLV-immunisierten Ziegen im Zeitraum eines Jahres und die diagnostischen Daten zu Infektion von Ziegen (Verhalten, Temperatur, bakterielle Nachweise, Korrelationen und minimale Infektionsdosis) ebenfalls von Interesse. Im Vergleich zu den NLV erzeugten die SSLV-immunisierten Tiere ähnliche oder höhere Antikörpertiter gegen die gemessenen Antigene, wobei die höchsten Titer gegen rPA83 und FIS erreicht wurden. Die Protein-basierenden Vakzinen vermittelten äquivalente Schutzraten zur SSLV (60 – 100 %), wobei der Zusatz von FIS tendenziell eine höhere Schutzwirkung (80 %) erzielte als ohne (50 %). Die DNA-immunisierten Tiere wurden aufgrund der geringen Serokonversion keiner Belastungsinfektion ausgesetzt. Generell war die Immunreaktion auf das in Mäusen hoch immunogen BclA in Ziegen sehr niedrig, was in weiterführenden Studien untersucht werden sollte und eine Basis für eine Verbesserung der Vakzinekomposition der NLV und SSLV bietet. Die Immunisierungen mit der SSLV ergaben eine unterschiedliche Wirksamkeit der Erstimmunisierung, die sich ebenfalls im Antikörperspektrum deutlich von der Auffrischungsimpfung unterschied. Zusammen mit den erhobenen Daten zum Titerverlauf innerhalb eines Jahres konnte ein Vorschlag zur Optimierung des Impfplans der SSLV, auch in Kombination mit einer Protein-basierenden NLV erarbeitet werden.