Impact of dietary phosphorus and fermentable substrates on the immune system and the intestinal microbiota of the pig

Abstract

Phosphorus (P) represents a crucial input for agriculture and food industries as a mineral present in ingredients used for livestock feeding as well as in mineral fertilisers. In the current systems, P is primarily derived from the finite mined phosphate rock resource. Thus, a critical challenge of global P scarcity is directly linked to future food security and sustainable resource management, especially in the European Union which is dependent on raw P from outside Europe. Apart from other future activities in animal nutrition, new dietary formulations of livestock diets emerged as a potential approach to increase the digestibility of plant P, phytate (myo inositol 1,2,3,4,5,6 hexakisphosphate, InsP6), and to reduce the supplementation with mineral phosphate. In non-ruminant animals, such as the pig, InsP6 hydrolysis is incomplete, as the small intestine lacks sufficient enzymes such as endogenous mucosal phytase and phosphatase. As a consequence, there is rising scientific interest to improve the understanding of InsP6 degradation in the digestive tract as well as the effects on nutritional factors and finally animal performance and health. The aim of the present thesis was to investigate the impact of dietary P, InsP6 and InsP6 hydrolysis products in combination with different fermentable substances (protein, carbohydrate) on the porcine immune system, the intestinal microbiota and animal health. First, a comprehensive literature overview describes the impact of P on the immune system and the microbiota along the gastrointestinal tract (GIT), including potential effects on host health with special focus on the pig. Secondly, an in vivo study with growing pigs was conducted to examine the effects of diets with varying mineral calcium-phosphorus (CaP) levels as well as different fermentable substrates on intestinal CaP concentration, InsP6 hydrolysis, the intestinal microbial ecosystem, and the peripheral and gut-associated immune system. In 2 consecutive experiments, 31 growing pigs (55 ± 4 kg) were allotted to a 2 × 2 factorial arrangement with 4 treatment groups, fed either a corn-soybean meal or a corn-pea based diet, each with 2 different CaP levels (low, 66% of the CaP requirement; high, 120% of the CaP requirement) supplemented with monocalcium phosphate and calcium carbonate. After 3 weeks of adaptation to the diets, all pigs were immunized twice with keyhole limpet hemocyanin (KLH). Blood and faeces samples were taken. After slaughtering, immunological tissue (jejunal, ileal mesenteric lymph nodes, spleen) as well as jejunal, ileal, caecal and colonic digesta were taken. Faecal and digesta samples were examined for P, Ca, inositol phosphate (InsP) isomers and for the marker titanium dioxide. The number of different leukocyte subpopulations analysed by flow cytometry, mitogen-induced lymphocytes proliferation in vitro were assessed. In addition, concentrations of plasma anti KLH IgM and plasma anti-KLH IgG analysed by ELISA and haematological parameters analysed by an automated hematology system have been measured in blood and tissue samples. In digesta samples, bacterial 16S rRNA gene copy numbers were determined by quantitative real-time PCR. The concentration of short chain fatty acids (SCFA) and ammonia was assessed. In addition, the use of terminal restriction fragment length polymorphism has been proven to characterize the structure of porcine gut microbiota. Results of the current study demonstrated that CaP and fermentable substrates had a distinct effect on the peripheral and gut-associated immune system, as well as on microbial composition and activity in growing pigs. High dietary CaP concentrations and the corn-pea diets increased P net absorption. Almost no InsP6 degradation could be observed in the GIT, and mainly myo inositol pentakisphosphate (InsP5) isomers were measured in jejunal, caecal digesta and faecal samples. In particular, the high CaP diets showed higher InsP6 and InsP5 concentrations, indicating a reduction of the initial steps of P release from InsP6 and a further breakdown of InsP5 isomers. The low CaP content might cause an impaired first line of defence and activation of the cellular and humoral adaptive immune response. As an example, the high CaP content affected the outcome of the adaptive immune response including a higher number of antigen experienced T-helper cells in the blood as well as higher plasma anti-KLH IgG concentrations. The reactivity of blood and mesenteric lymph node lymphocytes to Concanavalin A in these pigs was impaired, indicating modulating effects of other origin such as migration patterns or activity of antigen-presenting cells. Since results of the present study suggest contradictory effects of CaP level on immune cell numbers and lymphocyte reactivity in vitro and in vivo, further studies are needed to determine effects on cell signalling such as cytokine production profiles. Moreover, the high CaP content and the soybean meal diets increased the number of butyrate-producing bacteria, such as Eubacterium rectale and Roseburia spp. and increased the concentration of various SCFA in the small and large intestine, thereby contributing to improve gut health. Potentially harmful bacteria, such as Enterobacteriaceae and Bacteroides Prevotella Porphyromonas, were increased by the low CaP level and pea diets, indicating a less healthy microbiota. Results demonstrated that both, CaP supply and the amount of fermentable substrates, may beneficially affect gut health due to modulations of the composition and activity of the intestinal microbiota. Further studies should evaluate the impact of CaP on specific pathogenic bacteria known to produce toxic products creating a direct link to the immune system and animal health. Although most parameters of the present study indicate a positive effect of the high CaP diet, not all values showed a consistent effect on animal health, such as immune cell numbers and lymphocyte proliferation in vitro. In conclusion, variations in P availability and the formation of individual InsPs have to be considered when formulating diets in support of a stable intestinal microbial ecosystem and immune functions of the host.

Phosphor (P) leistet als Bestandteil von Futterrationen sowie von mineralischen Düngern einen bedeutenden Beitrag für die Landwirtschaft und Nahrungsmittelindustrie. Allerdings sind die globalen Rohphosphatvorkommen limitiert. Die globale P-Knappheit zieht entscheidende Herausforderungen im Bereich der nachhaltigen Nutzung dieser Ressource, einschließlich der damit verbundenen Ernährungssicherheit, nach sich. Von den Veränderungen betroffen ist vor allem die Europäische Union, die vollständig von Importen abhängig ist. Im Bereich der Tierernährung existieren zahlreiche Ansätze, die nachhaltige Nutzung von P zu fördern. Ein Ansatz liegt in der Formulierung neuer Rationen zur Steigerung der Verdaulichkeit von pflanzlichem P, Phytat-P (myo-Inositol 1,2,3,4,5,6-Hexakisphosphate, InsP6), und der Reduktion der Supplementierung mit mineralischem P. Nichtwiederkäuer wie das Schwein können nur einen geringen Teil des InsP6 hydrolysieren, da sie nur teilweise über die entsprechende enzymatische Ausstattung endogener mukosaler Phytasen und Phosphatasen im Verdauungstrakt verfügen. Aus diesem Grund besteht ein großes wissenschaftliches Interesse daran, das Verständnis über die Vorgänge beim Abbau von InsP6 im Verdauungstrakt und die damit verbundenen Effekte auf die Ernährung sowie letztendlich die Leistung und Gesundheit des Tieres zu verbessern. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss von P, InsP6 und InsP6 Hydrolyseprodukten und unterschiedlich fermentierbaren Substanzen (Proteine, Kohlenhydrate) in der Ration auf das Immunsystem, die intestinale Mikrobiota und die Tiergesundheit beim Schwein zu untersuchen. Auf Basis einer umfangreichen Literaturauswertung wurden mögliche Einflussfaktoren von P auf das Immunsytem und die Mikrobiota entlang des gastrointestinalen Verdauungstraktes mit Fokus auf das Schwein identifiziert. Zusätzlich wurden mögliche Effekte von P auf die Tiergesundheit abgeleitet. Auf dieser Grundlage wurde eine 2 × 2 faktoriell angelegte in vivo Studie mit Mastschweinen durchgeführt. Ziel war es, Effekte unterschiedlicher mineralischer Calcium-Phosphor (CaP) Konzentrationen und fermentierbarer Substanzen auf die intestinale CaP Konzentration, die InsP6 Hydrolyse, das intestinale mikrobielle Ökosystem und das darmassoziierte sowie periphere Immunsystem zu untersuchen. In zwei aufeinanderfolgenden Versuchen wurden 31 Mastschweine (55 ± 4 kg) entweder mit einer auf Mais-Sojaschrot oder Mais-Erbse basierten Ration gefüttert, die jeweils mit zwei unterschiedlichen CaP Konzentrationen (niedrig, 66% der CaP Empfehlung; hoch, 120% der CaP Empfehlung) in Form von Monocalciumphosphat und Calciumcarbonat ergänzt wurden. Nach einer dreiwöchigen Adaptation an die Futterration wurden alle Schweine zweimalig mit keyhole limpet hemocyanin (KLH) immunisiert. Blut- und Faecesproben wurden entnommen. Nach der Schlachtung wurde immunologisches Gewebe (jejunale, ileale mesenterische Lymphknoten, Milz) sowie Digesta aus Jejunum, Ileum, Caecum und Colon entnommen. P, Ca, Inositolphosphat (InsP) Isomere und der Marker Titandioxid wurden im Faeces und der Digesta bestimmt. Die Anzahl der Leukozytensubpopulationen wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen, außerdem wurde die mitogen induzierte Lymphozytenproliferation in vitro bestimmt. Zusätzlich wurde die Konzentration von anti-KLH IgM und anti-KLH IgG im Plasma mittels ELISA ermittelt und die hämatologischen Parameter mit einem Hämatologie-Analysator im Blut und Gewebe gemessen. In Digestaproben wurde die bakterielle 16S rRNA Genkopienanzahl mittels quantitativer real-time PCR und die Konzentration an flüchtigen kurzkettigen Fettsäuren und Ammoniak bestimmt. Zusätzlich wurde mittels terminal restriction fragment length polymorphism die Struktur der porcinen Darmmikrobiota charakterisiert. Die Ergebnisse zeigen, dass CaP und fermentierbare Substanzen einen Effekt auf das periphere und darmassoziierte Immunsystem, aber auch auf die mikrobielle Zusammensetzung und Aktivität bei Mastschweinen haben. Durch die hohe CaP Ration und die Mais-Erbsen Ration konnte eine Steigerung der P Nettoabsorption festgestellt werden. Der Abbau von InsP6 im gastrointestinalen Trakt war sehr gering, so konnten hauptsächlich myo Inositol Pentakisphosphat (InsP5) Isomere im Faeces, in jejunaler und caecaler Digesta ermittelt werden. Vor allem die hohe CaP Ration führte zu höheren InsP6 und InsP5 Konzentrationen, die auf eine Hemmung des initialen InsP6 Hydrolyseschrittes und die Entstehung von InsP5 Isomeren hindeuten. Tiere, die mit der geringen CaP Ration gefüttert wurden, zeigten eine schwächere angeborene Immunantwort, zusätzlich konnte eine veränderte zelluläre und humorale Immunantwort festgestellt werden. Die Fütterung der hohen CaP Ration führte zu einer Beeinflussung der adaptiven Immunantwort, welche sich in einer höheren Anzahl an Antigen-erfahrenen T-Helferzellen im Blut und einer höheren anti KLH IgG Konzentration im Plasma darstellte. Darüber hinaus konnte eine niedrigere Proliferation nach Stimulation mit Concanavalin A für Lymphozyten aus dem Blut und den mesenterischen Lymphknoten beobachtet werden, die auf modulierende Effekte anderen Ursprungs, beispielsweise Zellmigration oder die Aktivität von Antigen präsentierenden Zellen, hindeuten kann. Da die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit teilweise widersprüchliche Effekte der CaP Konzentration auf die Immunzellanzahl und Lymphozytenaktivität in vitro und in vivo vermuten lassen, sind weitere Studien nötig, um Effekte durch an der Zellkommunikation beteiligte Zytokine darzustellen. Im Hinblick auf die Mikrobiota konnte gezeigt werden, dass die Anzahl der Butyrat produzierenden Bakterien, wie Eubacterium rectale und Roseburia spp., und die Konzentration an unterschiedlichen kurzkettigen Fettsäuren im Dünn- und Dickdarm durch die hohe CaP Ration sowie die Sojaschrot Ration erhöht waren. Diese Effekte können auf eine Verbesserung der Darmgesundheit hindeuten. Die Anzahl potenziell schädlicher Bakterien, wie Enterobacteriaceae und Bacteroides-Prevotella-Porphyromonas, wurde durch die niedrige CaP Ration sowie die Erbsen Ration gesteigert, was auf eine weniger gesunde Mikrobiota hinweisen könnte. Die CaP Versorgung und der Gehalt an fermentierbaren Substanzen können möglicherweise einen positiven Effekt auf die Darmgesundheit haben, verursacht durch die Modulation der Zusammensetzung und Aktivität der intestinalen Mikrobiota. Weitere Studien sind daher notwendig, um Effekte von CaP auf spezielle pathogene Bakterien und deren toxische Substanzen zu untersuchen, um eine direkte Verbindung zwischen der intestinalen Mikrobiota, dem Immunsystem und der Wirkung auf die Tiergesundheit herzustellen. Obwohl die meisten Parameter der vorliegenden Studie auf einen positiven Effekt der hohen CaP Ration hindeuten, zeigten nicht alle Ergebnisse einen einheitlichen Effekt auf die Tiergesundheit, wie die Anzahl an Immunzellen und die Lymphozytenproliferation in vitro. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass Unterschiede in der P Verfügbarkeit und der Bildung einzelner InsPs bei Rationsformulierungen berücksichtigt werden sollten, um das mikrobielle Ökosystem und die Immunfunktionen des Tieres zu fördern.