Analysis of the emerging situation of resistance to succinate dehydrogenase inhibitors in Pyrenophora teres and Zymoseptoria tritici in Europe

Abstract

Phytopathogenic fungi such as Pyrenophora teres and Zymoseptoria tritici cause destructive diseases of barley and wheat in all major cereal production areas worldwide. The control of net blotch of barley caused by P. teres and Septoria tritici blotch (STB) of wheat caused by Z. tritici mainly relies on the usage of fungicides. Thereby, three single-site inhibiting fungicide classes, the quinone outside inhibitors (QoIs), the demethylation inhibitors (DMIs) and the succinate dehydrogenase inhibitors (SDHIs) have the highest relevance. The class of SDHIs is the most newly introduced fungicide class and inhibits the fungal succinate dehydrogenase complex (SDH) which is a critical enzyme of the respiratory chain and the tricarboxylic cycle. The upcoming SDHI resistance in European populations of P. teres and Z. tritici was investigated in the present study and resistance mechanisms underlying SDHI resistance were characterised. SDHI resistant isolates of both pathogens were collected in intensive monitoring programmes which covered the major barley and wheat growing areas in Europe. SDHI resistant isolates showed point mutations in the genes SdhB, SdhC and SdhD which cause amino acid alteration in the subunits B, C and D of the SDH complex. First SDHI resistant isolates of both pathogens were detected in 2012 and showed amino acid alteration, histidine to tyrosine at position 277 in SDH B (B-H277Y) in the case of P. teres and a threonine to asparagine exchange at position 79 in SDH-C (C-T79N) in the case of Z. tritici. In P. teres, a significant increase of SDHI resistant isolates from 2012 to 2015 was observed, particularly in countries such as France and Germany. Several target-site mutations leading to amino acid exchanges, namely B-H277Y, C-S73P, C-N75S, C-G79R, C-H134R, C-S135R, D-D124N/E, D-H134R, D-G138V, D-D145G and D-E178K, were identified in those isolates. Sequencing of SdhB, SdhC and SdhD genes of several isolates confirmed that each isolate carried one mutation in the Sdh genes, and not two or more in combination. In vitro and in planta sensitivity tests were performed and revealed that each SDH-variant causes a distinct resistance phenotype towards SDHIs. Commercially available SDHIs were compared and isolates showed cross-resistance towards all SDHIs tested, although some minor differences in the response to different mutations were observed. Most of the SDHI resistant P. teres isolates carried C-G79R substitution which was shown to exhibit one of the strongest effects of all detected alterations. In addition to C-G79R, other substitutions, such as C-N75S and D-D145G, were frequently found in the field. These SDH-variants were shown to confer low to moderate levels of resistance. In contrast to the rapid ‘build-up’ of resistant isolates in the population of P. teres in countries such as France and Germany, the emergence of SDHI resistance in Z. tritici did not evolve as fast as observed in net blotch. Here, only a few resistant isolates have been sampled so far (42 resistent of 3431 investigated isolates, 1.2%). An increase of resistant isolates of Z. tritici was observed mainly in Ireland, the United Kingdom and the Netherlands, however, still at low levels. SDH variants B-N225I, B-T268I/A, C-N86S/A, C-T79N/I, C-W80S, C-H152R and C-V166M were detected in SDHI resistant isolates collected in these and other countries such as France and Germany. Four isolates showed two mutations in the Sdh genes in combination. In vitro and in planta sensitivity measurements demonstrated that C-H152R mutants showed the highest resistance level of all investigated SDH variants collected in the field. C-T79N and C-N86S exchanges which have been detected more frequently in the field than C-H152R, were shown to confer lower levels of resistance compared to C-H152R. Both phytopathogenic species were shown to evolve a range of diverse target-site mutations, which led to different alterations in both pathogen species with exception of C-N75S in P. teres and the homologous variant, C-N86S, in Z. tritici. This can be explained by species-specific variation of the SDH enzyme, a different nature of the pathogens (e.g. host plants and disease geographical spread) as well as a different fungicide use pattern (e.g. mode of action diversity and fungicide application intensity). The absence of a dominant major target-site mutation in the case of SDHI resistance in both pathogens is thought to allow SDHIs as effective control agent against both pathogen species also in the future. Nevertheless, anti-resistance management strategies are highly recommended for the usage of SDHIs. These strategies should not only be based on the use of mixtures and alternations of fungicides but should also implement integrated disease control measurements (e.g. resistant host cultivars).

Phytopathogene Pilze wie Pyrenophora teres und Zymoseptoria tritici verursachen ertragsrelevante Krankheiten an Gerste und Weizen und sind in allen Getreide-anbaugebieten weltweit verbreitet. Die Bekämpfung der Netzfleckenkrankheit an Gerste, ausgelöst durch den Erreger P. teres, und der Septoria-Blattdürre an Weizen, ausgelöst durch den Erreger Z. tritici, wird größtenteils durch den Einsatz von Fungiziden gewährleistet. Dabei finden die drei „single-site“-Fungizid-Klassen der „Quinone-outside“-Inhibitoren (QoIs), der Demethylase-Inhibitoren (DMIs) und der Succinat-Dehydrogenase-Inhibitoren (SDHIs) den größten Einsatz. Die SDHIs repräsentieren die neuste der drei Fungizid-Klassen und inhibieren die pilzliche Succinat-Dehydrogenase (SDH), die ein wichtiger Bestandteil der Atmungskette und des Citrat-Zyklus in Lebewesen darstellt. Die Entstehung von Fungizid-Resistenzen in den Pflanzenpathogenen P. teres und Z. tritici gegenüber der Klasse der SDHIs und deren Charakterisierung war Bestandteil der vorliegenden Arbeit. Isolate beider Pathogene wurden in großangelegten „Monitoring“-Studien gesammelt und umfassten alle wichtigen Gersten- und Weizenanbaugebiete Europas. SDHI-resistente Isolate zeigten Punktmutationen in den Genen SdhB, SdhC und SdhD, die zu Aminosäure-Substitutionen in den SDH-B, SDH-C und SDH-D-Untereinheiten des SDH-Komplexes führen. Die ersten resistenten Isolate wurden im Jahr 2012 gesammelt und führten zu der Aminosäure-Substitution, Histidin zu Tyrosin an Position 277 der SDH B Untereinheit in P. teres (B-H277Y) und Threonin zu Asparagin an Position 79 der SDH-C Untereinheit in Z. tritici (C-T79N). Im Falle von P. teres wurde ein starker Anstieg der resistenten Isolate in den folgenden Jahren hauptsächlich in Deutschland und in Frankreich festgestellt. Die detektierten Punktmutationen führten zu den Aminosäure-Substitutionen B-H277Y, C-S73P, C-N75S, C-G79R, C-H134R, C-S135R, D-D124N/E, D-H134R, D-G138V, D-D145G und D-E178K. Die Sequenzierung der resistenten Isolate zeigte, dass jedes Isolat nur einen Austausch in der SDH aufwies, nie jedoch zwei oder mehr Substitutionen in einem Isolat aufzufinden waren. In vitro- und in planta-Sensitivitätsstudien wurden durchgeführt und zeigten, dass jede Substitution einen spezifischen Einfluss auf die Sensitivität der SDHIs hatte. Verschiedene SDHIs, die auf dem Markt erhältlich sind, wurden verglichen und es zeigte sich, dass sich alle SDHIs in Bezug auf die Resistenzstärke der einzelnen Mutationen ähnlich verhielten. Die meisten SDHI-resistenten Isolate von P. teres hatten den C-G79R-Austausch. Diese Substitution führte zu einem der stärksten Wirkungsverluste aller SDH-Varianten. Substitutionen, die einen schwächerem Wirkungsverlust der SDHIs aufwiesen, wie z.B. die C-N75S- und D-D145G-Substitution, wurden zusätzlich zur C-G79R häufig in der Feldpopulation gefunden. Im Vergleich zu dem raschen Aufkommen von SDHI-resistenten Isolaten von P. teres in Ländern, wie z.B. Deutschland und Frankreich, scheint die Entwicklung von SDHI-Resistenzen bei Z. tritici langsamer vonstattenzugehen. Bisher wurden nur wenige SDHI-resistente Z. tritici Isolate überhaupt gesammelt (42 resistente von 3431 untersuchten Isolaten, 1,2%). In Ländern wie Irland, Großbritannien und in den Niederlanden wurde auch bei Z. tritici ein Anstieg der resistenten Isolate beobachtet, jedoch nur in geringem Ausmaß. Die Aminosäure-Substitutionen B-N225I, B-T268I/A, C-N86S/A, C-T79N/I, C-W80S, C-H152R und C-V166M wurden in den resistenten Isolaten aus diesen und weiteren Ländern, wie Frankreich und Deutschland, über die Jahre gefunden. Der höchste Wirkungsverlust aller SDHIs wurde bei Isolaten mit der C-H152R-Substitution beobachtet. Die am häufigsten gefundenen SDH-Varianten, C-T79N und C-N86S, wiesen dagegen deutlich geringere Wirkungsverluste, verglichen mit der C-H152R-Substitution, auf. Es wurde gezeigt, dass beide phytopathogene Pilzarten eine hohe Anzahl an verschiedenen „Target-site“-Mutationen im Falle der SDHI-Resistenz entwickeln können und diese sich stark zwischen den beiden Pathogenen unterscheiden. Das kann mit der spezies-abhängigen Variation des SDH-Enzyms zusammenhängen, aber auch in der unterschiedlichen Biologie der Pathogene (z.B. Wirtpflanze, geographisches Vorkommen der Krankheiten) und einem unterschiedlichen Fungizid-Einsatz (z.B. Intensität in Gerste und Weizen) begründet liegen. Die Abwesenheit von einer dominanten „Target-site“-Mutation in beiden Pathogenen, wie z.B. im Falle der QoI-Resistenz durch G143A in Z. tritici, deutet darauf hin, dass SDHIs in der Zukunft immer noch effektiv zur Kontrolle beider Pflanzenkrankheiten eingesetzt werden können. Trotzdem ist ein Anti-Resistenz-Management für den Einsatz von SDHIs essentiell und sollte nicht nur auf Mischungen und Alternierung von Fungiziden beruhen, sondern auch integrierte Bekämpfungsstrategien stärker mit einbinden.