Immunomodulatory effects of resveratrol on human intestinal mast cell signaling in vitro and mast cell associated enteritis and colitis in mice

Abstract

By releasing their pre-stored or de novo synthesized mediators, mast cells (MC) are important immunoregulatory cells responsible for a variety of inflammatory reactions. Although known to be major effector cells in immunoglobuline (Ig) E dependent allergic reactions, MC have been widely shown to play a role in various inflammations of the gut. Diseases of the gastrointestinal tract (GIT) are widespread and multicausal. Those affected suffer from the sometimes severe symptoms and may experience restrictions on their daily life. Even if conventional medication is applied routinely, aim of the past and current research is to establish supportive and/or alternative medication that is based on natural substances. These may be on the basis of small natural components like resveratrol, a stilbene mostly found in grapes. Numerous positive properties are attributed to resveratrol. These are anti-inflammatory, anti-cancerogenic, anti-oxidative, as well as neuroprotective effects. The use of substances of natural origin as so-called nutraceuticals can help to increase the acceptance of medication by those affected, but also to reduce and overcome the side effects associated with conventional treatment. Effects of resveratrol were examined on the reactivity of MC isolated from patients’ tissue undergoing bowel resection. The results of this work show that resveratrol exhibited potent inhibitory effects on high affinity IgE receptor mediated activation of MC, strongly inhibiting not only MC degranulation, but also gene expression of the pro-inflammatory cytokines C-X-C motif chemokine ligand (CXCL) 8, C-C motif chemokine ligand (CCL) 2, CCL3, CCL4 and tumor necrosis factor (TNF-) α. Ultimately, the intracellular signaling cascade triggered during MC activation via IgE receptor leads to mediator release. Following IgE receptor mediated activation, phosphorylation of signaling molecules like extracellular signal-regulated kinase (ERK) 1/2 and signal transducer and activator of transcription (STAT) 3, occurs. ERK1/2 was found to be responsible for phosphorylation of mitochondrial STAT3, which contributes significantly to MC degranulation. Treatment with resveratrol was able to inhibit the phosphorylation of STAT3 by more than 50 % and that of ERK1/2 by almost 100 %. Furthermore, the experiments performed succeeded in isolating the mitochondrial fraction from relatively low human intestinal MC (hiMC) numbers. Also, in this fraction we could detect phosphorylation of STAT3 and ERK1/2 after MC activation, which was reduced after treatment with resveratrol. Having shown the strong inhibitory effects in vitro, we set out to examine immunomodulatory effects of resveratrol in vivo. Presence and activity of MC are closely related to intestinal inflammations in consequence of food allergy (FA) and inflammatory bowel disease (IBD). In mice, FA can be studied using the ovalbumin (OVA)-induced allergic enteritis model and colitis can be studied using the IL-10 knockout (-/-) mice, which develop a spontaneous form of chronic colitis. We could show that the oral application of resveratrol inhibited the increase of MC numbers in the colon and duodenum of affected animals in both experimental settings. Less pronounced but still visible effects of resveratrol administration were observed in the colon with regard to epithelial damage, cell infiltration and reduction of goblet cell numbers. In all cases, based on a scoring system, the damage decreased to the level of the corresponding controls receiving no additive and in which no allergic enteritis was induced or nor colitis developed. Overall, allergic enteritis resulted in a weaker symptomatology, and IL-10-/- animals showed a delayed appearance of the typical symptoms. The results of this thesis show a strong inhibitory effect of resveratrol on hiMC. This could be detected for mediator release as well as on gene expression levels and in the phosphorylation of the signaling molecules ERK1/2 and STAT3, which we could also identify in the mitochondria of hiMC. We observed positive influences on MC-associated parameters in the OVA enteritis and IL-10-/- colitis mouse models. With regard to its use as nutraceutical, resveratrol could therefore come more of a focus in the future.

Mastzellen sind wichtige immunregulatorische Zellen, die durch Freisetzung ihrer in den Granula gespeicherten oder der de novo synthetisierten Mediatoren für eine Vielzahl von Entzündungsreaktionen verantwortlich sind. Mastzellen, die in erster Linie als Haupteffektorzellen bei von Immunoglobulin (Ig) E abhängigen allergischen Reaktionen bekannt sind, spielen auch bei diversen Entzündungen des Darmes eine Rolle. Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes sind weit verbreitet und multikausal. Betroffene leiden aber immer mit unter der teils stark auftretenden Symptomatik und erfahren Einschränkungen im alltäglichen Leben. Auch wenn die herkömmliche Medikation zur Behandlung dieser Störungen routinemäßig Anwendung findet, ist es Ziel der Wissenschaft, eine unterstützende sowie Alternativmedikation zu entwickeln, die auf natürlichen Ausgangssubstanzen, wie z.B. dem in Trauben vorkommenden Stilben Resveratrol, basiert. Resveratrol werden zahlreiche positive Eigenschaften zugeschrieben. Darunter fallen anti-inflammatorische, anti-kanzerogene, antioxidative, als auch neuroprotektive Eigenschaften. Ein Einsatz von Substanzen natürlichen Ursprungs als sogenanntes Nutraceutical kann einerseits dazu dienen, die Akzeptanz der Medikation bei Betroffenen zu erhöhen, aber auch, die mit der herkömmlichen Behandlungsmethode verbundenen, Nebenwirkungen zu mindern und zu überwinden. Effekte von Resveratrol wurden auf die Reaktivität von Mastzellen, isoliert aus humanen intestinalen Resektionspräparaten (hiMC), geprüft. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass das Stilben starke inhibitorische Wirkung auf IgE-Rezeptor vermittelte Aktivierung von Mastzellen zeigt und dabei nicht nur die Mastzelldegranulation, sondern auch die Genexpression der pro-inflammatorischen Zytokine C-X-C motif chemokine ligand (CXCL) 8, C-C motif chemokine ligand (CCL) 2, CCL3, CCL4 und tumor necrosis factor (TNF-) α stark hemmt. Die, im Zuge der Mastzellaktivierung via IgE-Rezeptor, ausgelöste intrazelluläre Signalkaskade führt letztlich zur Mediatorausschüttung. Im Verlauf der Signalkaskade kommt es zur Phosphorylierung, d.h. der Aktivierung der Signalmoleküle extracellular signal-regulated kinase (ERK) 1/2 und signal transducer and activator of transcription (STAT) 3. Dabei ist ERK1/2 für die Phosphorylierung von mitochondrialem STAT3 verantwortlich, welches maßgeblich zur Mastzelldegranulation beiträgt. Die Behandlung mit Resveratrol führte dabei zur Hemmung der Phosphorylierung von STAT3 um mehr als 50 %, sowie die von ERK1/2 um fast 100 %. Des Weiteren gelang es uns, die mitochondriale Fraktion aus relativ geringen Mengen humaner intestinaler Mastzellen (hiMC) zu isolieren. Auch in dieser Fraktion konnten wir die Phosphorylierung von ERK1/2 und STAT3 nach Mastzellaktivierung detektieren, die nach einer Behandlung mit Resveratrol ebenfalls verringert war. Nachdem die stark hemmende Wirkung von Resveratrol in vitro gezeigt wurde, sollten die immunmodulatorischen Wirkungen auch in vivo überprüft werden. Das Vorhandensein und die Aktivität von MC stehen in engem Zusammenhang mit Entzündungen des Darms als Ursache von Nahrungsmittelallergien sowie chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen (CED). Im Mausmodell kann man Nahrungsmittelallergie mit Hilfe einer Ovalbumin (OVA)-induzierten allergischen Enteritis und CED mit Hilfe der IL-10 knockout (-/-) Maus, bei der es zu einer spontan auftretenden chronischen Colitis kommt, experimentell untersuchen. Wir konnten zeigen, dass die orale Gabe von Resveratrol bei betroffenen Tieren im Allergiemodell (OVA) als auch im Modell der murinen Colitis (IL-10-/-) zu einer Hemmung des Anstiegs der Mastzellanzahl im Gewebe von Colon und Duodenum betroffener Tiere führte. Weniger stark ausgeprägte, aber dennoch sichtbare Effekte bei einer Resveratrol-Gabe konnten im Colon im Hinblick auf Epithelschädigung und bei der IL-10-/- Colitis auch im Hinblick auf Zellinfiltration sowie Reduktion der Anzahl an Gobletzellen beobachtet werden. In allen Fällen verringerten sich die Schädigungen auf das Level der jeweiligen Kontrolltiere ohne allergische Enteritis bzw. Colitis. Insgesamt kam es bei der allergischen Enteritis zu einer schwächer ausgeprägten Symptomatik, bei IL-10-/- Tieren kam es insgesamt zu einem verzögerten Auftreten der typischen Symptomatiken. Die Ergebnisse dieser Promotionsarbeit zeigen eine stark inhibitorische Wirkung von Resveratrol auf hiMC. Diese ließen sich sowohl bei der Mediatorfreisetzung als auch auf Genexpressionslevel und in der Phosphorylierung der Signalmoleküle ERK1/2 und STAT3 zeigen, bei denen es gelungen ist, sie auch in den Mitochondrien von hiMC nachzuweisen. Auch im Mausmodell bei der Untersuchung einer allergisch induzierten Enteritis sowie einer murinen Colitis aufgrund eines IL-10-/- konnten wir positive Einflüsse auf Mastzell-assoziierte Parameter beobachten. Im Hinblick auf die Verwendung als Nutraceutical könnte Resveratrol deshalb zukünftig mehr in den Fokus rücken.