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Doctoral Thesis
2017
Untersuchungen zum Potential biotechnologischer Methoden zur Inaktivierung von tier- und humanmedizinischen Krankheitserregern der Schutzstufe 3
Untersuchungen zum Potential biotechnologischer Methoden zur Inaktivierung von tier- und humanmedizinischen Krankheitserregern der Schutzstufe 3
Hartmann, Nadja
Abstract (English)
With the increasing use of slurry in biogas plants there remains the question of the extent of the potential hazard for human and animal beings due to infectious pathogens which enter biogas plants through contaminated substrates. The aim of this doctoral thesis was to establish a suitable approach for the inactivation of infectious and zoonotic agents. Therefore, the fermentation process itself as well as potential pre- and post-procedures which can contribute to the inactivation of pathogens were analyzed. First of all, a laboratory process was established concerning an increase of temperature and dwelling time to analyze the consequences for the inactivation of the pathogens. Additionally, the possible impact of pasteurization and diverse substrates on the inactivation of different pathogens were investigated. The influence of storage to the contaminated substrates after the biogas process was also considered. Due to the distinctive tenacity of the bovine tuberculosis pathogens M. bovis and M. caprae as well as the paratuberculosis pathogen M. avium ssp. paratuberculosis (MAP). Those pathogens are used within this study. As another major cause of zoonotic, the obligate intracellular bacterium C. burnetii was used. This bacterium occurs also in high concentrations in slurry from animal populations which are tested positively of coxelliosis. Beside bacterial infection and zoonotic pathogens, viral agents are playing a major role, such as the highly contagious foot-and-mouth disease (FMD) and the virus classical swine fever (CSF). FMD was substituted by the equine rhinitis A virus (ERAV) and CSF by the bovine virus diarrhea (BVD). The results can be transferred to FMD and CSF because of the close phylogenetic relation of the surrogate viruses. The inactivation studies of M. bovis through storage over 21 days showed that there are besides the substrate and temperature specific differences also intraspecific differences. This fact should be included in future selection of the inactivation methods. At temperatures of 4 and 20 °C it was possible to detect mycobacteria throughout the entire experimental duration time. At 37 °C already after seven days no pathogens could be detected. Mycobacteria which were suspended in PBS were detectable during the whole experimental time. The storage studies with ERAV and BVDB were performed over 15 days with the different substrates. At low temperatures of 4 and 20 °C there was no significant virus reduction detectable. At higher temperatures (40 – 42 °C) after three days, a significant virus reduction for ERAV was detectable and a complete inactivation for BVD, respectively. Additionally, it could be proven, that the substrate has no impact on the reduction of ERAV. Experiments using ERAV absorbed membranes showed a substrate dependent inactivation at 40 °C. As a consequence, those adsorbed membranes were used for a biogas plant in a laboratory dimension for 24 hours in the style of the Hohenheim biogas yield test. The reduction of the titer could be seen at least after 120 minutes. Furthermore, it could be shown, that there is a significant reduction of the ERAV titer between 120 minutes and 24 hours. In regard to the success of pasteurization dependent on the substrate, no substrate dependency was found for mycobacteria. In experiments with M. bovis and M. caprae no pathogens could be found after 30 minutes incubation time at 60 °C. Investigations with MAP showed after 360 minutes at 70 °C no culturable pathogens. Pasteurization studies with C. burnetii showed no reliable data. The pasteurization studies of ERAV in dependence of three different substrates showed, that the reduction was only caused by temperature. Therefore, BVD was only combined with one substrate which had the most heterogenic composition. Concerning ERAV, after 15 minutes at 55 °C a significant reduction of the titer was detectable. For BVD at 40 °C no significant virus reduction was achieved, but a dependency of the substrate was proven. A significant reduction of the titer was achieved after 60 minutes at 45 °C in the substrate suspended viruses, 30 minutes at 50 °C, and for in cell culture suspended viruses after 60 – 120 minutes at 50 °C. The results of this thesis show the massive effect of the properties of individual pathogens on the duration of inactivation. This subordinate role should be considered within the choice of the suitable biotechnological process. To reduce the infectious risk the procedure should always orientate at the worst case: the pathogen with the highest tenacity.
Abstract (German)
Mit der steigenden Verwertung von Gülle und anderer Biomasse in Biogasanlagen stellt sich immer wieder die Frage nach der Gefährdung von Mensch und Tier durch die Verbreitung von Krankheitserregern, die über kontaminierte Substrate in die Biogasanlagen gelangen. Ziel dieser Arbeit war es, geeignete Inaktivierungsparameter für verschiedene hochkontagiöse Tierseuchenerreger und hochpathogene Bakterien zu verifizieren. Dafür wurde der Fermentationsprozess selbst sowie potentielle vor- und nachgelagerte Verfahren analysiert, die zu einer Inaktivierung möglicher im Input-Material vorhandenen Pathogene beitragen können. Zunächst wurde der Fermentationsprozess im Labor hinsichtlich einer Erhöhung der Temperatur und Verweilzeit angepasst, um zu sehen wie sich die Parameter auf die Inaktivierung von Pathogenen auswirken. Zudem wurden die Pasteurisierung und der mögliche Substrateinfluss auf das Inaktivierungsverhalten verschiedener Pathogene untersucht. Auch die an den Biogasprozess anschließende Lagerung kontaminierter Substrate wurde dabei betrachtet. Es wurden aufgrund der ausgeprägten Tenazität, die Erreger der Rindertuberkulose M. bovis und M. caprae sowie der Paratuberkulose M. avium ssp. paratuberculosis (MAP) verwendet. Als weiterer, ebenfalls wichtiger Zoonoseerreger wurde das obligat intrazelluläre Bakterium C. burnetii welches bei Coxielliose-positiven Tierbeständen in hohen Konzentration in Gülle nachgewiesen werden kann, untersucht. Neben bakteriellen Infektions- und Zoonoseerregern spielen auch virale Erreger eine große Rolle. Hierzu zählen die hochkontagiösen Viren der Maul- und Klauenseuche (MKS) und der Klassischen Schweinepest (KSP). Anstelle des MKS-Virus wurde das Equine Rhinitis A Virus (ERAV) und als Surrogat für das KSP-Virus wurde das Bovine Virusdiarrhoe Virus (BVDV) verwendet. Aufgrund ihrer jeweils engen phylogenetischen Verwandtschaft und vergleichbarer biologischer Eigenschaften sind die gewonnenen Ergebnisse der Surrogatviren auf das MKS- bzw. KSP-Virus übertragbar. Die Inaktivierungsversuche von M. bovis durch eine 21-tägige Lagerung ergaben substrat-, temperatur- sowie intraspezifische Unterschiede, die bei der Auswahl der Methode zur Inaktivierung berücksichtigt werden müssen. Bei Temperaturen von 4 und 20 °C konnten über die Dauer der Versuchslaufzeit Mykobakterien nachgewiesen werden. Nach bereits sieben Tagen konnten bei 37 °C keine Erreger mehr nachgewiesen werden. Die in PBS suspendierten Mykobakterien waren hingegen über die gesamte Versuchslaufzeit nachweisbar. Lagerungsversuche wurden mit ERAV und BVDV mit den verschiedenen Substraten bei über 15 Tage durchgeführt. Bei Temperaturen von 4 bzw. 20 °C fand eine signifikante Virusreduktion statt. Bei höheren Temperaturen (40 – 42 °C) zeigte sich bereits nach drei Tagen eine signifikante Virusreduktion (ERAV) bzw. lag der Titer unter der Nachweisgrenze (BVDV). Zudem wurde nachgewiesen, dass das Substrat keinen Einfluss auf die Reduktion von ERAV hat. Versuche mit auf Keimträgern adsorbiertem ERAV ergaben eine substratabhängige Inaktivierung bei 40 °C. Aufgrund dessen wurde mit diesen Keimträgern in Anlehnung an den Hohenheimer-Biogasertragstest der Biogasprozess im Labormaßstab für 24 Stunden simuliert. Es zeigte sich, dass erst ab mindestens 120 min ein Abfall des Virustiters stattfand. Im Verlauf zwischen 120 min und 24 Stunden fand eine signifikante Reduktion des ERAV-Titers statt. Im Rahmen der Pasteurisierungsuntersuchungen konnte bei den verschiedenen untersuchten Mycobacterium-Isolaten kein signifikanter Einfluss des Substrates auf den Pasteurisierungserfolg gefunden werden. Bei Versuchen mit M. bovis und M. caprae konnten bei 60 °C nach 30 min keine Erreger mehr nachgewiesen werden. Bei MAP konnten bei 70 °C erst nach 360 min keine kultivierbaren Erreger mehr nachgewiesen werden. Pasteurisierungsversuche mit C. burnetii lieferten keine belastbaren Daten. Bei der Pasteurisierung von ERAV in Abhängigkeit drei verschiedener Substrate zeigte sich, dass eine Reduktion allein durch die Temperatur hervorgerufen wurde, weshalb bei BVDV nur das Substrat mit der heterogensten Zusammensetzung verwendet wurde. Für ERAV konnte nach 15 min bei 55 °C ein signifikanter Titerverlust nachgewiesen werden. Bei BVDV konnte bei 40 °C keine signifikante Virusreduktion aber eine Substratabhängigkeit nachgewiesen werden. Bei den in Substrat suspendierten Viren konnte bei 45 °C nach 60 min sowie bei 50 °C nach 30 min eine signifikante Reduktion des Virustiters erzielt werden. Die in Zellkulturmedium suspendierten Viren zeigten diese Reduktion bei 50 °C nach 60 - 120 Minuten. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die Wichtigkeit, dass bei der Auswahl eines geeigneten biotechnologischen Prozesses die Eigenschaften der einzelnen Pathogene eine wichtige Rolle hinsichtlich der Inaktivierungsdauer spielen. Das Verfahren sollte sich daher stets am Worstcase, den Erregern mit der höchsten Tenazität, orientieren, um das infektiologische Risiko zu minimieren.
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Notes
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Publication series
Published in
Faculty
Faculty of Agricultural Sciences
Institute
Institute of Animal Science
Examination date
2017-11-08
Supervisor
Hölzle, Ludwig
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DOI
ISSN
ISBN
Language
German
Publisher
Publisher place
Classification (DDC)
570 Biology
Collections
Original object
Standardized keywords (GND)
BibTeX
@phdthesis{Hartmann2017,
url = {https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/6206},
author = {Hartmann, Nadja},
title = {Untersuchungen zum Potential biotechnologischer Methoden zur Inaktivierung von tier- und humanmedizinischen Krankheitserregern der Schutzstufe 3},
year = {2017},
school = {Universität Hohenheim},
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