Novel serine phosphorylation sites of IRS2 mediate 14-3-3 binding and regulate insulin signal transduction

Abstract

Insulin and insulin like growth factor (IGF)-1 mediate their metabolic and mitogenic effects on target tissues through activation of the insulin and IGF-1 receptor. Insulin receptor substrate (IRS) proteins function as intermediate docking platforms to transduce the insulin/IGF-1 signal to intracellular effector molecules that regulate glucose homoeostasis, lipid metabolism, cell proliferation and ß-cell survival. The activated receptors function as tyrosine kinases that phosphorylate IRS proteins on tyrosine residues, thereby generating interaction motifs for Src homology (SH) 2 domain containing proteins. Signal transduction via IRS proteins is furthermore regulated by their serine/threonine phosphorylation by several kinases and this can result in inhibitory or stimulatory consequences for downstream signalling. Hyperphosphorylation of IRS1 has been shown to be involved in the desensitization process that can result in insulin resistance. Both IRS1 and IRS2 undergo proteasomal degradation while particularly IRS2 levels are additionally regulated by cAMP-dependent gene activation. 14-3-3 proteins are versatile regulators of a variety of intracellular processes like control of cell cycle, cell growth, gene transcription and apoptosis. Serine/threonine phosphorylation within distinct motifs on the interaction partner is a prerequisite for 14-3-3 binding. IRS1 and IRS2 have been described as 14-3-3 interaction proteins and interaction of IRS2 with 14-3-3 proteins was specifically characterized in this thesis. Insulin/IGF-1-dependent PI 3-kinase stimulation as well as elevated cAMP levels were identified to modulate 14-3-3 binding to IRS2. IGF-1 stimulation led to increased binding of 14-3-3 to IRS2 in transfected HEK293 cells and this bind- ing was prevented by inhibition of the PI 3-kinase pathway and an Akt/PKB inhibitor. Insulin-stimulated interaction between endogenous IRS2 and 14-3-3 was observed in rat hepatoma cells and in mice liver after an acute insulin stimulus or refeeding. Application of different IRS2 fragments enabled localization of the IGF-1-dependent 14-3-3 binding region spanning amino acids 300-600. Mass spectrometric analysis produced a total of 24 phosphorylated serine/threonine residues on IRS2 after IGF-1 stimulation with 12 sites unique for IRS2 while the other residues are conserved in IRS1 and IRS2. The 24 identified phosphorylated residues on IRS2 included several 14-3-3 binding candidates in the region 300-600 and single alanine mutants of these candidates led to the identification of Ser573 as 14-3-3 binding site by overlay assays. A phosphosite specific antibody was generated to further characterize Ser573. IGF-1-dependent phosphorylation of Ser573 was reduced by inhibition of PI 3-kinase and Akt/PKB. The alanine mutant of Ser573 showed enhanced phosphorylation of Akt/PKB in an IGF-1 time course experiment. In summary, the data presented in this thesis indicate a negative impact of Ser573 phosphorylation on downstream signalling. Binding of 14-3-3 to IRS2 upon stimulation with forskolin and the cAMP analogue CPT-cAMP (8-(4-chlorophenylthio) adenosine 3?,5?-cyclic monophosphate) was demonstrated in HEK293 cells, that was prevented with the PKA inhibitor H89. The amino acid region behind position 952 on IRS2 was identified as cAMP/PKA-dependent 14-3-3 binding region by GST-14-3-3 pulldown as- says. Mass spectrometric analyses revealed Ser1137/Ser1138 as cAMP-dependent, potential PKA phosphorylation sites. Inhibition of Akt/PKB or ERK did not prevent the cAMP-dependent phosphorylation of IRS2 on PKA consensus motifs. Mutation of Ser1137/Ser1138 to alanine strongly reduced the cAMP-dependent 14-3-3 binding as shown by GST-14-3-3 pulldown experiments and co-immunoprecipitation assays. IRS2 protein degradation was demonstrated by the application of cycloheximide and an increased IRS2 protein stability was observed when HEK293 cells stably expressing IRS2 or primary hepatocytes were incubated with forskolin. This reduced IRS2 protein degradation was dependent on the presence of Ser1137/Ser1138, since stimulation with forskolin did not increase protein stability of the double Ala1137/Ala1138 mutant. To conclude, Ser1137/Ser1138 are presented as novel cAMP-dependent phosphorylation sites on IRS2 and their importance in 14-3-3 binding and IRS2 protein stability is demonstrated. This represents a novel mechanism for the cAMP- dependent upregulation of IRS2 protein levels that can be of importance for hepatic metabolism and ß-cell survival.

Insulin und Insulin like growth factor (IGF)-1 vermitteln ihre metabolischen und mitogenen Effekte in Zielgeweben durch die Aktivierung des Insulin- und des IGF-1-Rezeptors. Die Insulin Rezeptor Substrat (IRS) Proteine fungieren als intermediäre Bindungsstationen, über die das Insulin/IGF-1 Signal an intrazelluläre Effektormoleküle, welche die Glukosehomöostase, den Fettstoffwechsel, das Zellwachstum und das Überleben der ß-Zelle regulieren, weitergeleitet wird. Die Bindung von Insulin/IGF-1 aktiviert die Tyrosinkinaseaktivität des Rezeptors und führt zur Phosphorylierung der IRS Proteine an Tyrosinresten, wodurch Bindungsstellen für Proteine mit einer Src homology (SH) 2 Domäne generiert werden. Phosphorylierung von IRS Proteinen durch zahlreiche Serin/Threoninkinasen kann stimulatorische oder hemmende Auswirkungen auf die nachfolgende Signalkaskade zur Folge haben. Es konnte gezeigt werden dass die Hyperphosphorylierung von IRS1 zur Abschaltung des Insulinsignals beiträgt, was zur Insulinresistenz führen kann. IRS1 und IRS2 werden proteasomal degradiert, wobei vor allem IRS2 zusätzlich durch cAMP-abhängige Genaktivierung reguliert wird. 14-3-3 Proteine regulieren unterschiedliche intrazelluläre Prozesse wie Zellzyklus, Zellwachstum, Gentranskription und Apoptose. Die Serin/Threoninphosphorylierung in konservierten Motiven des Interaktionspartners ist eine Voraussetzung für die Bindung von 14-3-3 Proteinen. IRS1 und IRS2 wurden bereits als 14-3-3 Bindungspartner beschrieben und die Interaktion von IRS2 und 14-3-3 Proteinen wurde in der vorliegenden Dissertation genauer untersucht. Insulin/IGF-1 Stimulation und erhöhte cAMP-Spiegel konnten als Modulatoren der 14-3-3 Bindung an IRS2 identifiziert werden. IGF-1 Stimulation in transfizierten HEK293 Zellen führte zur Bindung von 14-3-3 an IRS2 wobei diese Bindung durch Inhibierung des PI 3-Kinase Signalweges und einen Akt/PKB-Kinase Inhibitor gehemmt werden konnte. Die Insulin-vermittelte Interaktion von 14-3-3 und endogenem IRS2 konnte in Ratten Hepatomzellen und in Mäuselebern nach akuter Insulinstimulation oder Nahrungsaufnahme beobachtet werden. Durch die Anwendung verschiedener Fragmente des IRS2 Proteins konnte die IGF-1-abhängige 14-3-3 Bindungsregion im IRS2 in den Bereich der Aminosäuren 300 ? 600 lokalisiert werden. Eine massenspektrometrische Analyse ergab 24 phosphorylierte Serin/Threoninreste im IRS2 Protein nach IGF-1 Stimulation, wovon 12 Stellen nur im IRS2 Protein gefunden wurden, während die anderen auch im IRS1 Protein konserviert sind. Unter den 24 identifizierten Phosphorylierungsstellen im IRS2 Protein befanden sich einige Kandidaten in der 14-3-3 Bindungsregion. Die Mutationen der Bindungskandidaten zu Alanin führte zur Identifizierung von Ser573 als 14-3-3 Bindungsstelle und es wurde ein phosphospezifischer Antikörper zur weiteren Charakterisierung der Stelle Ser573 hergestellt. Die Phosphorylierung von Ser573 durch IGF-1 Stimulation war nach Hemmung von PI 3-Kinase und Akt/PKB-Kinase reduziert. Die Alaninmutante von Ser573 zeigte eine verstärkte Phosphorylierung der Akt/PKB-Kinase in einer IGF-1 Zeitreihe. Zusammenfassend deuten die Daten auf einen negativen Einfluss der Phosphorylierung von Ser573 auf die nachfolgende Signalkaskade hin. Bindung von 14-3-3 an IRS2 durch Stimulation mit Forskolin oder dem cAMP Analogon CPT-cAMP (8-(4-chlorophenylthio) adenosin 3?,5?-zyklisches monophosphat) konnte in HEK293 Zellen gezeigt werden. Diese Bindung konnte mit dem PKA Inhibitor H89 gehemmt werden. Mittels GST pulldown Experimenten wurde die cAMP/PKA-abhängige 14-3-3 Bindungsregion in den Bereich der Aminosäuren 952 − 1321 im IRS2 lokalisiert. Eine massenspektrometrische Analyse identifizierte Ser1137/Ser1138 als cAMP-abhängige und potentielle PKA Phosphorylierungsstellen. Eine Hemmung von Akt/PKB-Kinase oder ERK-Kinase konnte die cAMP-abhängige Phosphorylierung von IRS2 an PKA-Konsensusstellen nicht verhindern. Die Mutation von Ser1137/Ser1138 zu Alanin führte zu einer starken Reduzierung der cAMP-abhängigen 14-3-3 Bindung in GST pulldown Experimenten und Ko-Immunpräzipitationen. Die Degradation des IRS2 Proteins wurde durch Cycloheximid sichtbar gemacht und eine erhöhte Stabilität konnte beobachtet werden, wenn HEK293 Zellen die stabil IRS2 exprimierten, oder primäre Hepatozyten mit Forskolin stimuliert wurden. Die reduzierte Proteindegradation war auf die Stellen Ser1137/Ser1138 zurückzuführen, da die Proteinstabilität der Ala1137/Ala1138-Mutante nicht durch Forskolinstimulation erhöht werden konnte. Ser1137/Ser1138 werden in dieser Dissertation als neue cAMP-abhängige IRS2 Phosphorylierungsstellen vorgestellt. Sowohl ihre Bedeutung bei der Interaktion von 14-3-3 und IRS2 als auch bei der IRS2 Proteinstabilität werden dargestellt. Die Ergebnisse deuten auf einen neuen Mechanismus für die cAMP-abhängige Erhöhung der IRS2 Proteinlevel hin, welche für den Metabolismus der Leber und das Überleben der ß-Zelle von Wichtigkeit sein könnte.