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Doctoral Thesis
2020
Vergleichende Transkriptomanalyse und funktionelle Untersuchungen von enterohämorrhagischen Escherichia coli nach Kultivierung in Pflanzenmedium
Vergleichende Transkriptomanalyse und funktionelle Untersuchungen von enterohämorrhagischen Escherichia coli nach Kultivierung in Pflanzenmedium
Abstract (English)
Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) are human pathogens which are able to cause severe gastrointestinal diseases in humans. The gastrointestinal tract of cattle is considered as the main reservoir for EHEC and contaminated raw meat represents the primary source of infection. Yet there have been increasing reports over the last few decades of EHEC infections that were linked to the consumption of raw vegetables. Today it is generally accepted that EHEC bacteria are able to use plants as their secondary hosts, thus favouring the transmission to humans. To improve the understanding of this pathogen-plant interaction fundamental knowledge about the pathogens’ molecular adaptions towards plant material is urgently required. In the cope of this study the adaption of different EHEC strains towards components of the plant was examined. Therefore O157:H7 strain Sakai, O104:H4 strain C227-11phicu and O157:H strain 3072/96 were chosen as surrogates. In growth experiments performed with an artificial lettuce medium it could be shown that components of the lettuce were sufficient for the proliferation of the three strains. RNA-sequencing was performed to study the differential gene expression of the three strains after the growth in lettuce medium compared to the growth in M9 minimal medium. In order to compare genes according to standardized gene denotations, the differential gene expression analysis was performed on the basis of a shared genome including the genomes of the three pathogenic strains as well as the genome of Escherichia coli strain K-12 substrain MG1655. Analogous to the successful growth in presence of components of the plant an upregulation of genes involved in carbohydrate and peptide metabolism throughout all three strains was observed. Especially genes involved in the catabolism of lactose (lacZ), ribose (rbsAC) and xylose (xylF) were found to be uniformly upregulated. The greatest differences among the strains accounted for the regulation of motility and chemotaxis genes. O104:H4 strain C227-11phicu showed a strong upregulation of all three classes of the flagellar hierarchy (class I, II and III) in presence of plant derived compounds. These included genes involved in the establishment of the basal body hook structure (fli, flg), the synthesis of the flagellar filament (fliC), and the chemotaxis-system (che, tap, tar). In contrast, O157:H7 strain Sakai only featured upregulation of class I and class II genes. According to the transcriptional data both of these strains also showed increased swimming and swarming behaviour on motility plates in presence of lettuce extract. Solely O157:H- strain 3072/96, which is non-motile due to a deletion in the flhC gene, showed an upregulation of virulence factors encoded on the LEE pathogenicity island, including genes involved in the establishment of the T3SS (esc) and T3SS secreted effectors (esp). Interestingly, it was shown for O157:H- strain 3072/96 to have a powerful capacity to form biofilms in M9 minimal medium. Furthermore it was proven that the complementation of an intact flhC gene restored motility in O157:H- strain 3072/96. In this regard it could be shown that the deletion in flhC was not the mere reason for the augmented biofilm formation capacity. In addition to the biofilm formation, the strains’ potential to adhere to HT-29 cells was examined. Here a significantly increased adherence potential for O157:H- strain 3072/96 with respect to the motile strains could be observed, the lowest adherence potential was determined for O157:H7 strain Sakai. The results presented in this study clearly indicate that the different EHEC strains are capable to adapt towards the nutrient availability provided by their plantal host. It can be assumed that flagella and the chemotaxis system play a fundamental role in the finding and exploitation of the plant. Furthermore curli structures might play a crucial role in the initial adherence and the subsequent establishment of a biofilm on plant tissues. Presumably, besides the typical plant associated outbreak strain O157:H7 strain Sakai, there are further strains capable of utilizing their genetic repertoire in order to adapt towards the atypical environmental conditions within this niche. The findings of this study suggest that the strains, besides sharing multiple coinciding mechanisms, are able to adapt in a strain specific manner and use different strategies in coping with plants as their secondary hosts.
Abstract (German)
Bei enterohämorrhagischen Escherichia coli (EHEC) handelt es sich um humanpathogene Bakterien, welche beim Menschen schwerwiegende gastrointestinale Erkrankungen auslösen können. Der Gastrointestinaltrakt von Rindern wird als Hauptreservoir von EHEC angesehen und die primäre Infektionsquelle des Menschen stellt kontaminiertes, rohes Fleisch dar. Jedoch kam es in den letzten Jahrzehnten vermehrt zu EHEC-Infektionen, welche mit dem Verzehr von rohem Gemüse und Salatpflanzen assoziiert wurden. Heute ist es anerkannt, dass diese Infektionen dadurch begünstigt werden, dass EHEC-Bakterien in der Lage sind, Pflanzen als Sekundärwirte zu nutzen und damit eine Übertragung auf den Menschen erleichtern. Um diese Interaktion zwischen Pathogen und Pflanze besser zu verstehen, sind grundlegende Kenntnisse in der molekularen Anpassung an pflanzliche Bestandteile nötig. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Anpassung verschiedener EHEC Stämme an pflanzliche Bestandteile untersucht, dazu wurden O157:H7 Stamm Sakai, O104:H4 Stamm C227-11phicu und O157:H- Stamm 3072/96 als Prototypen ausgewählt. Zunächst konnte in Wachstumsexperimenten in einem artifiziellen Salatmedium gezeigt werden, dass Inhaltsstoffe des Salatmediums für ein erfolgreiches Wachstum aller drei Stämme ausreichend waren. In der RNA-Sequenzierung wurde die differentielle Genexpression der drei Stämme nach Wachstum in Salatmedium gegenüber dem Wachstum in M9-Minimalmedium bestimmt. Um Gene zwischen den Stämmen anhand einer einheitlichen Genbezeichnung miteinander zu vergleichen, wurde die differentielle Genexpression mit der Grundlage eines geteilten Genoms der drei pathogenen Stämme inklusive Referenzstamm Escherichia coli Stamm K-12 Substamm MG1655 durchgeführt. Analog zum erfolgreichen Wachstum in Anwesenheit pflanzlicher Bestandteile zeichnete sich eine erhöhte Transkription von zahlreichen Genen des Kohlenhydrat- und Peptidmetabolismus in allen drei Stämmen ab. Besonders die Gene des Lactose- (lacZ), Ribose- (rbsAC) und Xylosemetabolismus (xylF) waren in allen Stämmen deutlich hochreguliert. Die deutlichsten transkriptionellen Unterschiede zwischen den Stämmen zeigten sich in der Regulation von Motilitäts- und Chemotaxis-Genen. O104:H4 Stamm C227-11phicu zeigte in Anwesenheit pflanzlicher Bestandteile eine starke Expression aller Gene der drei Flagellenklassen (Klasse I, II und III). Dazu gehören die Gene, welche für den Aufbau der Flagellengrundstruktur (fli, flg), der Ausbildung des Filaments (fliC) sowie des Chemotaxis-Systems (che, tar, tap) verantwortlich sind. Dem entgegen konnte bei O157:H7 Stamm Sakai ausschließlich eine erhöhte Expression der Klasse I und II Flagellengene beobachtet werden. In Übereinstimmung mit den Transkriptomdaten zeigten diese beiden Stämme ein gesteigertes Schwimm- und Schwärmverhalten auf Motilitätsplatten in Anwesenheit von Salatextrakt. Ausschließlich bei dem, ausgelöst durch eine Deletion im Gen flhC, unbeweglichen O157:H- Stamm 3072/96 konnte eine gesteigerte Expression von Virulenzfaktoren der LEE-Pathogenitätsinsel beobachtet werden. Dazu gehörten Gene für den Aufbau des T3SS (esc) sowie T3SS-vermittelten Effektoren (esp). Interessanterweise äußerte sich dieser Stamm als leistungsfähiger Biofilmbildner in M9-Minimalmedium. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Komplementierung des intakten flhC-Gens die Beweglichkeit von O157:H- Stamm 3072/96 wieder herstellen konnte. In diesem Zusammenhang konnte ebenfalls festgestellt werden, dass die Deletion im Gen flhC nicht der alleinige Grund für die erhöhte Biofilmbildung dieses Stammes war. Zusätzlich zur Bestimmung der Biofilmbildung wurden die Stämme auf ihre Adhärenz an HT-29 Zellen untersucht. Hierbei konnte für O157:H- Stamm 3072/96 gegenüber den motilen Stämmen eine signifikant erhöhte Adhärenz beobachtet werden, das geringste Adhärenzpotential konnte bei O157:H7 Stamm Sakai festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Studie liefern klare Hinweise, dass die verschiedenen EHEC-Stämme fähig sind, sich an die Nährstoffverfügbarkeiten in einem pflanzlichen Wirt anzupassen. Es kann davon ausgegangen werden, dass Flagellen und das Chemotaxis-System eine entscheidende Rolle in der Auffindung von Pflanzen und deren Erschließung spielen. Außerdem könnten Curli-Strukturen eine elementare Funktion bei der initialen Anheftung und der anschließenden Biofilmbildung auf pflanzlichem Gewebe spielen. Vermutlich sind, neben dem typischen Pflanzen-assoziierten Ausbruchstamm O157:H7 Stamm Sakai, auch weitere EHEC-Stämme in der Lage ihr genetisches Repertoire auszunutzen, um eine Antwort auf die atypische Bedingungen dieser Nische zu gewährleisten. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse legen nahe, dass die Stämme aufgrund ihrer unterschiedlichen genetischen Ausstattung, neben zahlreichen übereinstimmenden Mechanismen, zusätzlich auch stammspezifische Strategien bei einer Interaktion mit Pflanzen als Sekundärwirte zeigen.
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Faculty
Faculty of Natural Sciences
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Institute of Food Science and Biotechnology
Examination date
2020-01-08
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Language
German
Publisher
Publisher place
Classification (DDC)
570 Biology
Original object
Free keywords
Standardized keywords (GND)
BibTeX
@phdthesis{Bufe2020,
url = {https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/6461},
author = {Bufe, Thorsten},
title = {Vergleichende Transkriptomanalyse und funktionelle Untersuchungen von enterohämorrhagischen Escherichia coli nach Kultivierung in Pflanzenmedium},
year = {2020},
school = {Universität Hohenheim},
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