ATP4 and Wnt-signaling are required for ciliogenesis and left-right axis development of Xenopus

Abstract

The vertebrate body plan displays left-right (LR) asymmetries of organ placement superimposed on an overt bilaterally symmetrical organization. Symmetry is broken during embryogenesis, and asymmetric gene expression precedes asymmetric organ morphogenesis. The proton/potassium pump ATP4 was shown to play a role in LR-development of the frog Xenopus laevis as well as in other deuterostomes. Two opposing models of symmetry-breakage were proposed, the ?ion-flux? and the ?leftward flow? model. The former proposed that symmetry was broken by LR-asymmetric expression of the a-subunit of ATP4 during cleavage stages. The latter claimed a cilia-based leftward flow at the gastrocoel roof plate (GRP) to take center stage during neurulation, i.e. a day later in development. In the present thesis work, the role of ATP4a in symmetry-breakage was re-addressed and evidence for symmetrical expression and function of ATP4a was gathered. ATP4a was shown to be required for two Wnt-signaling dependent steps during the setup of cilia driven leftward flow at the GRP: (1) Wnt/b-catenin (b-cat) dependent expression of Foxj1 during gastrulation, and (2) Wnt/planar cell polarity (PCP) dependent posterior localization of motile cilia during neurulation. These data challenge the ?ion-flux? hypothesis and argue for a conserved ATP4- and cilia-dependent symmetry-breakage mechanism throughout the vertebrates. Furthermore, the function of Wnt-signaling components was analyzed in the context of GRP-formation: The receptor Frizzled 8 (Fz8) and b-cat were required for Foxj1 expression during gastrulation. Morphogenesis of the GRP, posterior polarization of motile cilia and expression of Xnr1 and Coco in somitic cells were all required for LR-development. Loss of non-canonical Xwnt11b-signaling perturbed these process, suggesting that non-canonical Wnt-signaling branches, in addition to Wnt/PCP, were relevant for LR-development. ATP4-mediated Wnt-signaling was also required for Foxj1 expression and motile cilia in other epithelia during Xenopus development, i.e. the skin, floor plate and the ependymal cell layer. In the floor plate b-cat was required for Foxj1 expression downstream of Hedgehog-signaling. In the skin mucociliary epithelium ATP4a and Wnt/b-cat were required downstream of Notch/Delta-mediated cell-type specification of multiciliated cells. This was also true for a new cell type of serotonergic cells described here, which was characterized morphologically, by analysis of gene expression and response to manipulations of Wnt- and Notch/Delta-signaling. In summary, the data presented in this thesis suggest a conserved function of ATP4a and Wnt-signaling in vertebrate symmetry-breakage and Foxj1-dependent ciliogenesis in Xenopus.

Wirbeltiere weisen Links-Rechts-(LR-)Asymmetrien in der Positionierung ihrer inneren Organe auf, welche von dem im Allgemeinen bilateral-symmetrischen Körperbauplan überlagert werden. Die bilaterale Symmetrie wird während der Embryonalentwicklung gebrochen, dabei geht die asymmetrische Aktivität von Genen der asymmetrischen Organmorphogenese voraus. Der Protonen/Kalium-Pumpe ATP4 wurde eine Rolle während der LR-Entwicklung von Xenopus laevis und weiteren Deuterostomiern zugesprochen. Zum Ablauf des Symmetriebruchs wurden jedoch zwei gegensätzliche Modelle vorgeschlagen: das ?Ionen-Fluss?- und das ?Flüssigkeitsstrom?-Modell. Während das erste Modell impliziert, dass eine LR-asymmetrische Verteilung der a-Untereinheit von ATP4 in Furchungsstadien zum Symmetriebruch führt, schlägt das zweite Modell vor, dass ein cilienabhängiger, linksgerichteter Flüssigkeitsstrom über Zellen der Archenteron-Dachplatte (GRP) zum Symmetriebruch während Neurulastadien führt. Dies wäre ein Tag später in der Entwicklung als vom ?Ionen-Fluss? Modell vorgeschlagen.

In dieser Arbeit wurde die Funktion von ATP4a während des Symmetriebruchs nochmals näher untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse legten eine symmetrische Verteilung und Funktion von ATP4 während der LR-Entwicklung nahe. Es konnte gezeigt werden, dass die Funktion von ATP4a in zwei Wnt-abhängigen Signalprozessen für die Entstehung des linksgerichteten Flüssigkeitsstroms benötigt wurde: (1.) Für die Wnt/b-Catenin-abhängige Expression von Foxj1 während der Gastrulation, und (2.) für die Wnt/PCP-abhängige (planare Zellpolarität) posteriore Positionierung von motilen Cilien während der Neurulation. Diese Daten stellten die ?Ionen-Fluss?-Hypothese in Frage und unterstützten die Idee eines konservierten Symmetriebruch-Mechanismus in Wirbeltieren, welcher ATP4- und Cilien-abhängig ist.

Zudem wurden die Funktionen von weiteren Komponenten des Wnt-Signalwegs währen der Entstehung der GRP untersucht: Der Rezeptor Frizzled 8 (Fz8) und b-Catenin wurden für die Expression von Foxj1 während der Gastrulation benötigt. Funktionsverlust des non-kanonischen Liganden Xwnt11b hingegen störte die Morphogenese der GRP, die posteriore Ausrichtung von motilen Cilien, sowie die Expression von Coco und Xnr1 in somitischen Zellen der GRP. Dies legte nahe, dass neben Wnt/PCP die Aktivität weiterer non-kanonischer Signalzweige des Wnt-Signalweges für die LR-Entwicklung notwendig waren.

ATP4-abhängige Wnt-Signalaktivität war auch für die Expression von Foxj1 und die Entstehung motiler Cilien in anderen ciliierten Epithelien während der Entwicklung von Xenopus notwendig: z.B. in der Haut, der neuralen Bodenplatte und im Ependym. In der Bodenplatte des Neuralrohrs wurde b-Catenin dem Hedgehog-Signalweg nachgeschaltet für die Foxj1 Expression benötigt. Im mucociliären Epithel der Haut wurden ATP4a und Wnt/b-Catenin gebraucht, nachdem die Zellen über den Notch/Delta-Signalweg spezifiziert wurden. Diese Art der Regulation wurde auch in einem neuen Zelltyp serotonerger Zellen beobachtet, welcher hier mittels morphologischer Analyse, Analyse der Genexpression und anhand der Reaktion auf Manipulation des Notch/Delta-Signalwegs charakterisiert wurde.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die in dieser Dissertation vorgelegten Daten für eine evolutionäre Konservierung der Funktionen von ATP4a und des Wnt-Signalweges beim Symmetriebruch der Wirbeltiere sprechen, sowie eine Verbindung zwischen ATP4a und Wnt bei der Foxj1-abhängigen Entstehung von Cilien in Xenopus herstellen.