Identification and quantification of tocomonoenol isomers in plants and microalgae and investigation of their metabolism in liver cells

Abstract

Tocopherols (T), tocomonoenols (T1), and tocotrienols (T3) are tocochromanols, a group of bioactive compounds composed of a chromanol ring and a 16-carbon sidechain with biological functions, such as the protection of lipid membranes from oxidation and the modulation of cellular signaling. T have saturated sidechains, while T1 and T3 have a single or three double bonds in theirs, respectively. The prefixes alpha-, beta-, gamma-, and delta- are assigned based on the number and positions of methyl groups on the chromanol ring. alpha-, beta-, gamma-, and delta-congeners of T1 have been reported, with alpha-T1 being the predominantly identified congener. Two different alpha-T1 isomers are known, 11-alpha-T1, which has been mainly found in land plants, and 12-alpha-T1, which has been mostly detected in marine organisms. However, little is known regarding the occurrence of T1 in photosynthetic organisms and their metabolism in the liver, a strong determinant of bioavailability and bioactivity. The aim of this thesis was to evaluate underutilized plant-based food sources, cyanobacteria, and microalgae as potential sources of T1 and to characterize the uptake and conversion into metabolites of T1 in cultured liver cells in comparison to T and T3. Acrocomia aculeata fruits were analyzed for alpha-T1 due to its phylogenetic relationship with Elaeis spp, the most common source of this congener. No alpha-T1 was detected in oils from endosperm and mesocarp of wild fruits of Acrocomia aculeata from Costa Rica. Aerial parts of the local underutilized leafy vegetable Urtica leptophylla were evaluated as source of T1 due to its agronomical potential and previous reports of T1 in leaves of plants. LC-MS analyses indicated that leaves and flowers of Costa Rican Urtica leptophylla contain minor amounts of alpha-T1 and gamma-T1. Cyanobacteria and microalgae from different species and origins were analyzed as source of alpha-T1 due to their role as primary producers in aquatic ecosystems and the reported presence of 12-alpha-T1 in marine phytoplankton. alpha-T1 in cyanobacteria and microalgae ranged from traces up to 17% of the total tocochromanol content. alpha-T1 concentrations alone were higher than the sum of all four T3. 11-alpha-T1 was the major alpha-T1 isomer in cyanobacteria and microalgae, as determined by GC-MS. Hence, 11-alpha-T1 is a product of biosynthetic pathways even in aquatic organisms. The effect of nitrogen depletion during the cultivation of microalgae on their alpha-T1 content was investigated. Nitrogen depletion did neither significantly affect the relative or absolute content of alpha-T1, despite an increase in tocochromanol content, nor the proportion of 11-alpha-T1/12-alpha-T1 in microalgae. The uptake and conversion into metabolites of 11-alpha-T1 in HepG2 liver cells was compared to those of alpha-T3 and alpha-T. Cellular uptake of alpha-T1 in liver cells was higher than that of alpha-T. 11-alpha-T1, similar to alpha-T, was converted mostly to alpha-carboxymethylhydroxychroman in a time dependent manner, but to lower extend than alpha-T3. The effect of both ring methylation and sidechain saturation on the uptake and metabolism of the alpha- and gamma-congeners of T1, T and T3 was studied in HepG2 cells. gamma-Congeners were metabolized at higher extent than alpha-congeners and metabolite production increased with increasing number of double bonds in the sidechain independently of chromanol ring methylation. In conclusion, alpha-T1 is present with up to 17% of total tocochromanols in cultured microalgae, which thus are an important new source of this congener. gamma-T1 is only a minor tocochromanol in U. leptophylla flowers. 11-alpha-T1, and not 12-alpha-T1, is the major alpha-T1 isomer in cyanobacteria and microalgae and nitrogen depletion of microalgae does not significantly affect alpha-T1 concentration. The metabolic conversion of alpha-T1 into alpha-carboxymethylhydroxychroman in HepG2 cells is similar to that of alpha-T and significantly lower than that of alpha-T3, suggesting that it may be handled by the organism similar to alpha-T. In conclusion, novel potential food sources of alpha-T1 have been identified and, because of similarities with alpha-T, its pharmacokinetics and biological activities warrant further investigation.

Tocomonoenole (T1), Tocopherole (T) und Tocotrienole (T3) gehören zur Familie der Tocochromanole, einer Gruppe bioaktiver Substanzen, die aus einem Chromanolring und einer Seitenkette aus 16 Kohlenstoffatomen bestehen. Während T eine gesättigte Seitenkette aufweisen, haben T1 eine einfach ungesättigte und T3 eine dreifach ungesättigte Seitenkette. Je nach Anzahl und Stellung von Methylgruppen am Chromanolring werden alpha-, beta-, gamma-, und delta-Kongenere unterschieden. Es wurden bereits alpha-, beta-, gamma- und delta-Kongenere der T1 beschrieben, wobei alpha-T1 das am Häufigsten gefundene T1-Kongener darstellt. Zwei verschiedene alpha-T1-Isomere sind bekannt: 11-alpha-T1, welches hauptsächlich in terrestrischen Pflanzen, und 12-alpha-T1, welches hauptsächlich in marinen Quellen gefunden wurde. Über mögliche Quellen für alpha-T1 und seinen Metabolismus in der Leber ist bislang nur wenig bekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, neue Quellen für T1 zu identifizieren sowie den Metabolismus von T1 in Leberzellen zu erforschen und mit dem von T und T3 zu vergleichen. Acrocomia aculeata wurde aufgrund seiner phylogenetischen Verwandtschaft mit Elaeis spp., einer Quelle für alpha-T1, auf den Gehalt dieses Kongeners hin untersucht. Im Endosperm- und Mesokarp von Früchten wilder Acrocomia aculeata aus Costa Rica konnte kein alpha-T1 nachgewiesen werden. Die oberirdischen Teile von Urtica leptophylla wurden aufgrund seines agronomischen Potenzials und vorangegangener Berichte über T1 in Blättern von Pflanzen als mögliche Quelle von T1 untersucht. Mittels LC-MS-Analyse wurden geringe Mengen an alpha-T1 und gamma-T1 in den Blättern und Blüten von Urtica leptophylla gefunden. Cyanobakterien und Mikroalgen unterschiedlicher Arten und Herkunft wurden aufgrund ihrer Rolle als Primärproduzenten in aquatischen Ökosystemen und des Vorkommens von 12-alpha-T1 in Phytoplankton als mögliche Quelle von alpha-T1 untersucht. Die Gehalte an alpha-T1 im Cyanobakterium Arthrospira platensis und in Mikroalgen der Gattungen Chlorella, Tetraselmis, Nannochloropsis und Monodopsis variierten vom Spurenbereich bis zu einem Anteil von bis zu 17% der Gesamt-Tocochromanolkonzentration. 11-alpha-T1 war das quantitativ wichtigste Isomer in allen Mikroalgen, unabhängig von Art und Herkunft, und in höheren Konzentrationen enthalten als T3. Der Einfluss eines Stickstoffmangels während der Kultivierung von Mikroalgen auf deren alpha-T1-Gehalte wurde erforscht. Die Kultivierung der Mikroalge Monodopsis subterranea unter Stickstoffmangel erhöhte den Tocochromanolgehalt, nicht aber die Konzentration von alpha-T1. Auch das Verhältnis von 11-alpha-T1 zu 12-alpha-T1 wurde nicht durch Stickstoffmangel beeinflusst. Weiterhin wurde die Aufnahme von 11-alpha-T1 in HepG2-Leberzellen und seine Umwandlung zu Metaboliten untersucht und mit denen von alpha-T und alpha-T3 verglichen. In mit Tocochromanolen inkubierten Leberzellen (HepG2) war die Aufnahme der T1 in die Zelle höher als die der T. 11-alpha-T1 wurde in einem ähnlichen Umfang wie alpha-T, aber einem geringeren als alpha-T3 vorwiegend in alpha-Carboxymethylhydroxychroman umgewandelt. Der Einfluss der Ringmethylierung sowie der Sättigung der Seitenkette auf die Aufnahme und Umwandlung der alpha- und gamma-Kongenere von T1, T und T3 wurde in HepG2 Zellen untersucht: Die metabolische Konversion der Tocochromanole nahm mit zunehmender Zahl an Doppelbindungen in der Seitenkette zu. gamma-Kongenere wurden stärker als alpha-Kongenere umgewandelt. Die Ergebnisse dieses Promotionsprojektes zeigen, dass alpha-T1 mit bis zu 17% des Gesamt-Tocochromanolgehalts in kultivierten Mikroalgen vorhanden und 11-alpha-T1, und nicht 12-alpha-T1, das wichtigste alpha-T1-Isomer in Mikroalgen ist. Weiterhin lässt sich schlussfolgern, dass ein Stickstoffmangel während der Kultivierung keinen Einfluss auf alpha-T1-Konzentrationen in Mikroalgen hat und gamma-T1 nur in geringen Mengen in Urtica leptophylla-Blüten vorhanden ist. Zum ersten Mal konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Umwandlungsrate von alpha-T1 zu alpha-Carboxymethylhydroxychroman in HepG2-Zellen mit der von alpha-T vergleichbar und signifikant geringer als die von T3 ist, was darauf hindeutet, dass es im Organismus ähnlich wie alpha-T behandelt wird. Somit wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit neue Lebensmittelquellen für alpha-T1 identifiziert und Erkenntnisse über seinen Stoffwechsel gewonnen, die, aufgrund der Ähnlichkeit zu alpha-T, weitere Studien zu seiner Pharmakokinetik und seinen biologischen Aktivitäten rechtfertigen.