Regulation of fibroblast growth factor 23 (FGF23) in metabolic derangement

Abstract

Increased incidence of metabolic syndrome is attributable to Western dietary patterns. Metabolic syndrome enhances risk of developing diabetes mellitus type 2 or cardiovascular diseases, which are associated with lactic acidosis, diabetic ketoacidosis and hyperhomocysteinemia. Increased lactate, ketone body or homocysteine levels are therefore relevant indicators of impaired metabolism and pathogenesis. FGF23 is an important regulator of calcitriol and phosphate homeostasis, and is predominantly synthesized in bone cells. Synthesis of FGF23 is regulated by various mechanisms including insulin/IGF1, mTOR, AMPK, PPARα, inflammation and oxidative stress. Increased FGF23 serum levels are correlated to inflammatory, renal and cardiovascular diseases, thus FGF23 represents an important therapeutic target and disease marker. Investigations unveiling regulation of FGF23 expression and synthesis as well as underlying mechanisms are therefore of high clinical significance. Hence, the present work aimed to elucidate a relevance of impaired metabolism on FGF23 formation, therefore establishing a basis for improved diagnosis as well as therapeutic approaches reducing morbidity and mortality in lactic acidosis, diabetic ketoacidosis or hyperhomocysteinemia. To this end, regulation of FGF23 synthesis under the influence of lactate, ketone bodies and homocysteine was analyzed. Lactic acid and sodium lactate enhanced Fgf23 expression in UMR106 osteoblast-like cells, an effect translated into higher cFGF23 concentration in cell culture supernatants. Application of NFκB inhibitors wogonin and withaferin A demonstrated an NFκB-mediated up-regulation of Fgf23 expression through lactic acid. Despite the knowledge that NFκB is an inducer of FGF23 formation and lactate stimulates NFκB activity, this study is the first to reveal a direct regulation of lactate on FGF23 production. As lactic acidosis is a common comorbidity in diabetes mellitus type 2 or cancer and increased lactate serum concentrations are associated with higher mortality, the findings of this study demonstrate FGF23 to be another useful biomarker for disease monitoring and prognosis. Furthermore homocysteine is a new regulator of FGF23 synthesis as shown within the present work, thus increasing Fgf23 expression and cFGF23 abundance in UMR106 cells. This effect is mediated by enhanced oxidative stress which stimulates FGF23 production, and is abolished by application of anti-oxidative ascorbic acid. Homocysteine serum levels are associated with versatile pathologies and its link to FGF23 signaling is therefore of clinical relevance, particularly in cardiovascular and renal diseases. In another investigation as part of this work, the ketone body βHB was identified as stimulator of FGF23 synthesis in UMR106 osteoblast-like cells as well as in primary cardiomyocytes, NRVM. Within NRVM, regulation of Fgf23 expression was shown to be dependent on MCT1/2 and HCAR2. Furthermore, intracellular activation of NFκB by βHB impacting on FGF23 synthesis was demonstrated in UMR106 cells. Moreover, short-term fasting (16 h) or βHB sodium salt administration increased FGF23 serum concentrations in C57BL/6 mice. These effects are of high relevance, since fasting-induced FGF23 synthesis was associated with lower NaPi-IIa and αklotho expression as well as with higher Cyp24a1 expression. In line with high FGF23 levels and enhanced Cyp24a1 expression, calcitriol serum levels of fasted animals were significantly lower compared to mice fed ad libitum. Other serum parameters including phosphate, calcium and PTH did not differ between both study groups. Further investigations revealed an important role of the heart as well as of thymus, spleen and pancreas in fasting-induced FGF23 synthesis. However, Fgf23 expression in bone and bone marrow did not differ between fasted mice and mice fed ad libitum, and was not detectable in liver tissue. As fasting and ketone body production are thought to be beneficial for various diseases and longevity, the findings of this investigation have enormous clinical implications. Since FGF23 has been demonstrated to be an important disease marker, and fasting induces FGF23 synthesis, blood samples of patients in fasting states may require careful interpretation. In conclusion, the present work is the first to demonstrate a direct regulation of FGF23 synthesis through lactate, ketone bodies and homocysteine. Hereby, NFκB signaling and generation of oxidative stress play a pivotal role. As FGF23 formation has been shown to be regulated through short-term fasting and to impact on phosphate homeostasis within the present work, the findings are highly implicated in physiology and pathophysiology. With respect to development of cardiovascular or renal diseases through lactic acidosis, diabetic ketoacidosis and homocysteinemia as well as to the relevance of FGF23 in these pathologies, the results of the present work are of significance for improved disease monitoring and establishment of new therapeutic approaches. Future investigations examining an involvement of metabolic regulators, e.g. insulin, mTOR, AMPK, PPARα, or of FGF co-receptor αklotho may provide further promising targets for therapy, diagnosis and prognosis of metabolic diseases.

Die steigende Inzidenz des metabolischen Syndroms in industrialisierten Ländern lässt sich auf westliche Ernährungsmuster zurückführen. Das metabolische Syndrom erhöht das Risiko an Diabetes mellitus Typ 2 oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu erkranken, welche mit Laktatazidose, diabetischer Ketoazidose und Hyperhomocysteinämie einhergehen. Erhöhte Laktat-, Ketonkörper- oder Homocysteinspiegel sind daher wichtige Indikatoren für einen beeinträchtigten Stoffwechsel und die Pathogenese. FGF23 ist ein wichtiger Regulator der Calcitriol- und Phosphathomöostase und wird vorwiegend in Knochenzellen synthetisiert. Die Synthese von FGF23 wird durch verschiedene Mechanismen reguliert, darunter Insulin/IGF1, mTOR, AMPK, PPARα, Entzündungen und oxidativer Stress. Erhöhte FGF23-Serumspiegel werden mit entzündlichen-, Nieren- und Herz-Kreislauf-Erkrankungen assoziiert und FGF23 stellt somit einen wichtigen therapeutischen Angriffspunkt sowie Krankheitsmarker dar. Untersuchungen, welche die Regulation der FGF23-Expression und -Synthese sowie die zugrunde liegenden Mechanismen aufdecken, sind daher von hoher klinischer Relevanz. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Bedeutung eines veränderten Stoffwechsels für die FGF23-Bildung aufzuklären. Dies könnte eine Grundlage für eine verbesserte Diagnostik sowie für weitere therapeutische Ansätze bieten, welche die Morbidität und Mortalität bei Laktatazidose, diabetischer Ketoazidose oder Hyperhomocysteinämie reduzieren. Zu diesem Zweck wurde die Regulation der FGF23-Synthese unter dem Einfluss von Laktat, Ketonkörpern und Homocystein analysiert. Laktat und Laktat-Natriumsalz verstärkten die Expression von Fgf23 in UMR106 Osteoblasten-ähnlichen Zellen, und erhöhten folglich die cFGF23-Konzentration im Zellkulturüberstand. Die Anwendung der NFκB-Inhibitoren, Wogonin und Withaferin A, zeigte eine NFκB-vermittelte Steigerung der Fgf23-Expression durch Laktat. Trotz der Kenntnis der NFκB-induzierten Bildung von FGF23 und der Stimulation der NFκB-Aktivität durch Laktat, zeigt diese Studie erstmals eine direkte Regulation der FGF23-Synthese durch Laktat. Da die Laktatazidose eine häufige Begleiterscheinung von Diabetes mellitus Typ 2 oder Krebserkrankungen ist, und erhöhte Laktat-Serumkonzentrationen mit einer höheren Sterblichkeit einhergehen, zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass FGF23 ein weiterer nützlicher Biomarker für das Krankheitsmonitoring und die -Prognose ist. Darüber hinaus wurde Homocystein in der vorliegenden Arbeit als neuer Regulator der FGF23-Synthese identifiziert und erhöht somit die Fgf23-Expression sowie die cFGF23-Konzentration in UMR106-Zellen. Dieser Effekt wird durch die gesteigerte Bildung von oxidativem Stress vermittelt, welcher die FGF23-Produktion stimuliert, und durch den Zusatz von antioxidativer Ascorbinsäure aufgehoben wird. Der Homocystein-Serumspiegel wird mit verschiedenen Pathologien in Verbindung gebracht und dessen Zusammenhang mit intrazellulären FGF23-Signalwegen ist daher von klinischer Bedeutung, insbesondere für Herz-Kreislauf- und Nierenerkrankungen. In einer weiteren Untersuchung im Rahmen dieser Arbeit wurde der Ketonkörper βHB als Stimulator der FGF23-Synthese in UMR106 Osteoblasten-ähnlichen Zellen sowie in primären Kardiomyozyten, in NRVM, identifiziert. In NRVM wurde gezeigt, dass die Regulation der Fgf23-Expression MCT1/2- und HCAR2-abhängig ist. Zudem wurde in UMR106-Zellen eine intrazelluläre Aktivierung von NFκB durch βHB aufgezeigt, welche die FGF23-Synthese beeinflusst. Darüber hinaus erhöhte kurzzeitiges Fasten (16 h) oder die Verabreichung von βHB-Natriumsalz die FGF23-Serumkonzentrationen in C57BL/6-Mäusen. Diese Effekte sind von hoher Relevanz, da die Fasten-induzierte FGF23-Synthese mit einer geringeren NaPi-IIa- und αklotho-Expression sowie einer höheren Cyp24a1-Expression einherging. Im Einklang mit den höheren FGF23-Spiegeln und der verstärkten Cyp24a1-Expression waren die Calcitriol-Serumspiegel der gefasteten Tiere im Vergleich zu den ad libitum gefütterten Mäusen signifikant verringert. Andere Serumparameter, einschließlich Phosphat, Kalzium und PTH, unterschieden sich zwischen den beiden Studiengruppen nicht. Weitere Untersuchungen zeigten eine wichtige Rolle des Herzorgans sowie von Thymus, Milz und Pankreas für die Fasten-induzierte FGF23-Synthese. Die Expression von Fgf23 in Knochen und Knochenmark unterschied sich zwischen gefasten und ad libitum gefütterten Mäusen nicht, und war im Lebergewebe nicht nachweisbar. Da Fasten und die Ketonkörpern-Produktion für verschiedene Krankheiten und die Lebensdauer als vorteilhaft gelten, haben die Ergebnisse dieser Untersuchung eine erhebliche klinische Bedeutung. Da FGF23 ein nachweislich wichtiger Krankheitsmarker ist und Fasten die FGF23-Synthese stimuliert, sollten Blutproben von Patienten im nüchternen Zustand sorgfältig interpretiert werden. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit erstmals eine direkte Regulation der FGF23-Synthese durch Laktat, Ketonkörper und Homocystein. Dabei spielen NFκB-Signalwege oder die Bildung von oxidativem Stress eine zentrale Rolle. Da in der vorliegenden Arbeit gezeigt wurde, dass die FGF23-Bildung durch kurzzeitiges Fasten reguliert wird und Einfluss auf die Phosphathomöostase nimmt, sind die Ergebnisse von physiologischer und pathophysiologischer Bedeutung. In Bezug auf die Entstehung von kardiovaskulären- oder renalen Erkrankungen durch Laktatazidose, diabetische Ketoazidose und Homocysteinämie sowie aufgrund der Relevanz von FGF23 in diesen Pathologien, sind die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit von Relevanz für ein verbessertes Krankheitsmonitoring und die Etablierung neuer therapeutischer Ansätze. Zukünftige Untersuchungen, die eine Beteiligung von Stoffwechselregulatoren, wie z.B. Insulin, mTOR, AMPK, PPARα, oder des FGF-Co-Rezeptors αklotho untersuchen, könnten weitere vielversprechende Angriffspunkte für Therapie, Diagnose und Prognose von Stoffwechselerkrankungen liefern.