Interplay between nutrition, senescence and cytosine methylation in Arabidopsis thaliana

Abstract

In monocarpic plants, senescence is the last stage of leaf development and usually leads to the death of the organism. Systematic degradation of leaf components provides nutrients for the newly developing flowers and seeds. The physiology and transcriptional changes that occur in A. thaliana during this process are very well documented. However, the involvement of epigenic mechanisms remains to be established. In this study, the role of cytosine methylation in the regulation of monocarpic leaf senescence was examined in A. thaliana. Hypomethylated ddc (drm1/2 cmt3) and hypermethylated ros1 mutants showed consistent senescence-specific phenotypes. Disrupted de-novo methylation resulted in delayed, while disrupted demethylation resulted in earlier flowering and appearance of first symptoms of senescence. Both genotypes executed the senescence program faster than Col-0, with lower leaf:seed and higher C:N ratios. During nitrogen, or phosphorus withdrawal and resupply, nutrient remobilization was not inhibited in the two mutants. However, the plant’s response in terms of changes in shoot and root growth was delayed, or non existent. Furthermore, the impact of N withdrawal on delay of the flowering time was inhibited in the two mutants. These results support involvement of cytosine methylation in stress response signaling and downstream effects on organ development and flowering times. The stress response and senescence specific phenotypes of ddc could be partially due to disrupted WRKY signaling, as loss of methylation in W-box binding sites was prevalent, specifically near the transcription start sites of ORFs, and WRKY18, 25 and 53 appeared to be sensitive towards cytosine methylation. Overall decrease in cytosine methylation levels was observed, as early as the opening of the first flowers, together with a decrease in chlorophyll concentrations and an increase in H2O2 and glucose levels in the wild type Col-0. Inhibition in maintenance methylation in the early stages of reproductive growth is consistent with these observations. A complex interaction between four cytokinins was present as early as flower induction, followed by a mass turnover of bound auxin (IAA) at flower opening, that resulted in near doubling of free IAA at seed development. Plant defense responses were induced thereafter, as an increase in salicylic acid (SA) and camalexin occurred, followed by an increase in jasmonic acid (JA) and abscisic acid (ABA). Active RNA-dependent DNA methylation (RdDM) was indicated by a moderate overrepresentation of hypermethylated CHG and CHH loci, together with partial recovery of total methylation levels at the latest stages during seed maturation. Considering the delayed senescence phenotype of ddc, de-novo methylation via RdDM appears to be involved in initiation and execution of the senescence program. Furthermore, hypomethylation at ROS1 gene regulatory region was related to down regulation of gene expression. As an antagonist of RdDM, together with the early senescence phenotype of ros1, these results strengthen the importance of de-novo methylation for senescence, while active demethylation gets down regulated. Overall, methylation changes were little related to known gene expression changes that are associated with senescence. Limited targeting of WRKY and bZIP binding sites hinders conclusions about senescence specific effects of cytosine methylation in signal transduction networks. Altogether, the present work shines light on the importance of proper maintenance of cytosine methylation for flowering time, nutrient remobilization and senescence, and identifies defined cytosine methylation changes during senescence in a comprehensive physiological framework.

Bei monokarpen Pflanzen ist die genetisch programmierte Seneszenz das letzte Stadium der Blattentwicklung. Die Seneszenz führt normalerweise zum Absterben der grünen Pflanzenteile, allerdings nicht der Samen. Der systematische Abbau von Blattbestandteilen liefert Nährstoffe für die sich neu entwickelnden Blüten und Samen. Die physiologischen und transkriptionellen Veränderungen, die bei A. thaliana während dieses Entwicklungsprozesses auftreten, sind sehr gut dokumentiert. Die Beteiligung von epigenetischen Mechanismen an diesem Prozess ist jedoch noch unklar. In dieser Studie wurde die Rolle der Cytosinmethylierung der genomischen DNA bei der Regulation der Seneszenz von monokarpen Blättern in A. thaliana untersucht. Hypomethylierte ddc ( drml/2 cmt3) und hypermethylierte rosl-Mutanten zeigten konsistente, seneszenzspezifische Phänotypen. Eine gestörte de-novo-Methylierung führte zu einer Verzögerung des Alterns, während eine gestörte Demethylierung zu einer früheren Blüte und früherem Auftreten der ersten Symptome der Seneszenz führte. Beide Genotypen durchliefen das Seneszenzprogramm schneller als der Wildtyp Col-0, was zu niedrigerem Blatt:Samen- und höherem C:N-Verhältnis führte. Während und nach transientem Stickstoff- oder Phosphormangel wurde die Nährstoff-Remobilisierung in den beiden Mutanten nicht gehemmt, war jedoch verzögert. Darüber hinaus wurde der verzögernde Einfluss des Stickstoffmangels auf den Blütezeitpunkt in den beiden Mutanten beeinflusst. Die vorliegenden Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass die Cytosinmethylierung an der Signalübertragung der Stressantwort beteiligt ist und Auswirkung auf die Organentwicklung und die Blütezeite hat. Die stressreaktions- und seneszenzspezifischen Phänotypen von ddc könnten teilweise auf eine gestörte WRKY­Signalübertragung zurückzuführen sein, da ein Methylierungsverlust an W-Box-Bindungsstellen, insbesondere in der Nähe der Transkriptionsstartstellen von ORFs gefunden wurde. Darüber hinaus war die Bindung der Transkriptionsfaktoren WRKY18, 25 und 53 an Zielsequenzen sensitiv gegenüber Cytosinmethylierung. Eine allgemeine Abnahme der DNA Methylierung im alternden Blatt wurde bereits zur ersten Blüte beobachtet, parallel zu einer Abnahme der Chlorophyllkonzentration und dem Anstieg der H2O2- und Zuckergehalte im Wildtyp Col-0. Die Hemmung der Erhaltungsmethylierung in früheren Stadien der Blattentwicklung stimmt mit diesen Beobachtungen überein. Eine komplexe Wechselwirkung verschiedener Cytokinine war bereits bei der Blüteninduktion pffensichtlich, gefolgt von einem massivem Abbau von gebundenem Auxin (IAA) während des Öffnens der Blüten. Das führte zu einer nahezu Verdoppelung des freien IAA während der Samenentwicklung. Pflanzenabwehrreaktionen wurden durch Anstieg von Salicylsäure (SA) und Camalexin nachgewiesen, gefolgt von einem Anstieg von Jasmonsäure (JA) und Abscisinsäure (ABA). Während der Samenreifung sind die letzten Lebensvorgänge im Blatt durch eine Überrepräsentation von hypermethylierten CHG- und CHH-Loci gekennzeichnet, was teilweise das Gesamtmethylierungsniveau wiederherstellte und auf aktive RNA-abhängige DNA Methylierung (RdDM) hinweist. In Anbetracht des Phänotyps des späteren Seneszenzbeginns von ddc scheint die de­novo-Methylierung über RdDM in den Beginn und die Ausführung des Seneszenzprogramms involviert zu sein. Darüber hinaus war die Hypomethylierung in des ROS1-Locus mit reduzierter Genexpression verbunden. Als Antagonist von RdDM wird die aktive Demethylierung offenbar herunterreguliert, zusammen mit dem Phänotyp der frühen Seneszenz von rosl unterstreicht dies die Bedeutung der de­novo-Methylierung für die Seneszenz. Die Methylierungsänderungen waren nicht spezifisch für Seneszenz-assoziierte Gene, die begrenzten Änderungen der Methylierung von WRKY- und bZIP­Bindungsstellen lassen nur begrenzte Schlussfolgerungen auf veränderte Signaltransduktionsnetzwerke zu. Insgesamt belegt die vorliegende Arbeit die Bedeutung der Cytosinmethylierung für den Blütezeitpunkt und die Seneszenz. Änderungen der genomischen Cytosinmethylierung während der Seneszenz werden in einen umfassenden physiologischen Rahmen eingebettet.