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Abstract (English)
This study investigated age-dependent DNA methylation patterns to estimate chronological age. DNA methylation is a covalent bond of a methyl group at the 5'-carbon atom of a cytosine, which in mammals occurs almost exclusively in sequences of cytosine-phosphate-guanine, so-called CpG sites. For criminal proceedings, it is highly relevant whether a person has reached a legally relevant age limit of 14, 18 or 21 years. Estimating the age is also relevant for unaccompanied refugee minors who are entitled to special protection by law. There is often a lack of valid documents that can confirm that they are minors. Furthermore, estimating the age of unknown perpetrators of biological crime scene evidence can support police investigations in order to narrow down the circle of possible trace donors. In 2016, the German Ethics Commission expressed that they do not consider the medical methods currently used to estimate age to be suitable, as they violate the fundamental rights to physical integrity, human dignity and the general right to privacy. As buccal mucosal swabs or saliva samples represent a practicable, cost-effective and, above all, non-invasive alternative, an estimation model based on buccal mucosa was sought. The first research hypothesis covered age estimation of adolescents and young individuals. First, 88 age-dependent CpG sites of the eight markers PDE4C, ELOVL2, ITGA2B, ASPA, EDARADD, SST, KLF14 and SLC12A5 were analysed by bisulphite conversion and subsequent pyrosequencing. For this purpose, 141 buccal mucosal swabs from individuals between 21 and 69 years of age were analysed. In 54 of the 88 CpG sites analysed (in six markers PDE4C, ELOVL2, EDARADD, SST, KLF14 and SLC12A5), age-dependent methylation patterns were identified. This study showed that a reliable estimation of age is possible using as little as three CpG sites (PDE4C, EDARADD and KLF14) and that this model can also be successfully transferred to another sequencing method, namely minisequencing. In the second step, research focused on estimating the age of adolescent individuals. For this purpose, buccal swabs from 230 individuals between 1 and 88 years of age were used. Eight CpG sites of already established markers (PDE4C, EDARADD, SST, KLF14, ELOVL2, FHL2, C1orf132 and TRIM59) were analysed using mini sequencing. After analysing the correlation of the methylation status of the individual CpG sites with the chronological age of the test subjects, a logarithmic rather than linear relationship from birth to adulthood was observed, particularly for the markers ELOVL2 and TRIM59. To deal with this phenomenon, 20 years was defined as the ‘cut-off’ value, at which the chronological age is transformed in order to adjust the chronological age to the epigenetic age. A MAD of 4.680 years was thus achieved in the training set and a MAD of 4.695 years in the independent validation set. The estimates were most accurate in the lower age segment from 0 to 19 years (MAD of only 2.64 years), thus achieving the goal of a model that is suitable for age estimation for adolescents and young adults. To answer the second research hypothesis, the contribution of hydroxymethylation to the improvement of age estimation models was analysed. The term DNA methylation usually refers to 5-methylcytosine (5mC), but bisulphite conversion cannot distinguish between 5- hydroxymethylcytosine (5hmC) and 5mC. By subjecting a portion of the sample to an oxidation step prior to bisulphite conversion, in which 5hmC is oxidised and later treated like an unmethylated cytosine, 5mC and 5hmC can be analysed separately. Methylation values of 40 CpG sites in eight markers (EDARADD, PDE4C, SST, KLF14, SLC12A5, TOX2, LRRN2 and STK12A) were analysed by pyrosequencing in 108 individuals. Estimation models including 5hmC markers or take ydroxymethylation into account reveal similar accuracy as those that only take 5mC markers (so-called ‘true 5mC methylation’) into account and models based on the gold standard (undifferentiated 5mC+5hmC values). In any case, this makes 5hmC another promising marker for forensic age estimation. However, no significant improvement in estimation accuracy was achieved, which is why the second research hypothesis could not be confirmed. The 5hmC methylation values of individual CpG sites showed weak to moderate correlations with chronological age. The literature indicates that 5hmC shows better genome- wide correlation with age than 5mC and that it also regulates different genes. This suggests that the best 5hmC markers for age estimation may not yet have been found. Methods that can analyse longer sections of the genome are better suited for a future search for the best markers.
Abstract (German)
Die vorliegende Arbeit untersuchte altersabhängige DNA-Methylierungsmuster zur Schätzung des chronologischen Alters. Bei der DNA-Methylierung handelt es sich um ein Cytosin mit einer kovalenten Bindung einer Methylgruppe am 5‘-Kohlenstoffatom, das in Säugetieren fast ausschließlich in Cytosin-Phosphat-Guanin Abfolgen auftritt sog. CpG-Stellen. Aus strafrechtlicher Sicht hat es eine hohe Relevanz, ob eine Person bestimmte juristisch relevante Altersgrenzen von 14, 18 bzw.21 Jahren erreicht hat. Zudem ist die Schätzung des Alters bei minderjährigen, unbegleiteten Flüchtlingen relevant, denen per Gesetz besonderer Schutz zusteht. Oftmals fehlen valide Dokumente, die die Minderjährigkeit bestätigen können. Die Schätzung des Alters unbekannter Verursacher biologischer Tatortspuren kann darüber hinaus polizeiliche Ermittlungen unterstützen, um den Kreis möglicher Spurenverursacher einzugrenzen. Die deutsche Ethikkommission machte 2016 in einer Stellungnahme klar, dass sie die derzeitig angewendeten medizinischen Methoden zur Altersschätzung für nicht geeignet halten, da sie die Grundrechte auf körperliche Unversehrtheit, Menschenwürde und das Allgemeine Persönlichkeitsrecht verletzten. Da Wangenschleimhautabriebe eine praktikable, kostengünstige und vor allem non-invasive Alternative darstellen, wurde ein Schätzungsmodell anhand von Wangenschleimhaut angestrebt. Die erste Forschungshypothese umfasste die Lebensaltersschätzung von Heranwachsenden und jungen Personen. Zunächst wurden 88 altersabhängige CpG-Stellen der acht Marker PDE4C, ELOVL2, ITGA2B, ASPA, EDARADD, SST, KLF14 und SLC12A5 mittels Bisulfitkonvertierung und anschließender Pyrosequenzierung untersucht. Dazu wurden 141 Wangenschleimhautabriebe von Individuen zwischen 21 und 69 Jahren analysiert. Bei 54 der 88 untersuchten CpG-Stellen (in sechs Markern PDE4C, ELOVL2, EDARADD, SST, KLF14 und SLC12A5) ließen sich dabei altersabhängige Methylierungsmuster feststellen. Anhand dieser Studie konnte gezeigt werden, dass ein zuverlässiges Schätzen des Alters bereits ab nur drei CpG-Stellen (PDE4C, EDARADD und KLF14) möglich ist, und dass dieses Modell sich auch erfolgreich auf eine andere Sequenziermethode übertragen lässt, nämlich die Minisequenzierung. Im zweiten Schritt lag der Fokus verstärkt auf der Schätzung des Alters heranwachsender Personen. Dazu wurden Wangenschleimhautabriebe von 230 Individuen zwischen 1 und 88 Jahren verwendet. Untersucht wurden acht CpG-Stellen von bereits etablierten Markern (PDE4C, EDARADD, SST, KLF14, ELOVL2, FHL2, C1orf132 und TRIM59) mittels Minisequenzierung. Nach Analyse der Korrelation des Methylierungsstatus der einzelnen CpG-Stellen mit dem chronologischen Alter der Testpersonen zeigte sich insbesondere bei den Markern ELOVL2 und TRIM59 ein eher logarithmischer als linearer Zusammenhang von der Geburt bis zum Eintritt in das Erwachsenenalter. Um mit diesem Phänomen umzugehen, wurden 20 Jahre als „Cut Off“-Wert festgelegt, bis zu dem das chronologische Alter transformiert wird, um das chronologische an das epigenetische Alter anzupassen. Im Trainingsset konnte so ein MAD von 4,680 Jahren erreicht werden und im unabhängigen Validierungsset ein MAD von 4,695 Jahren. Insbesondere im unteren Alterssegment von 0 bis 19 Jahren waren die Schätzungen am genauesten (MAD von nur 2,64 Jahren), womit das Ziel eines Modells, das sich zur Altersschätzung für Heranwachsende und junge Erwachsene eignet, erreicht wurde. Zur Beantwortung der zweiten Forschungshypothese wurde untersuchte, ob die Berücksichtigung der Hydroxymethylierung signifikant zur Verbesserung von Altersschätzungsmodellen beiträgt. Unter dem Begriff DNA-Methylierung ist zumeist 5- Methylcytosine (5mC) gemeint, dabei kann die Bisulfitkonvertierung nicht zwischen 5- Hydroxymethylcytosine (5hmC) und 5mC unterscheiden. Indem man einen Teil der Proben einem Oxidationsschritt vor der Bisulfitkonvertierung unterzieht, bei dem 5hmC oxidiert wird und später wie ein unmethyliertes Cytosin behandelt wird, lassen sich 5mC und 5hmC getrennt voneinander analysieren. Methylierungswerte von 40 CpG-Stellen in acht Markern (EDARADD, PDE4C, SST, KLF14, SLC12A5, TOX2, LRRN2 und STK12A) wurden mittels Pyrosequenzierung an 108 Personen analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Schätzungsmodelle, die 5hmC-Marker mit einbeziehen bzw. die Hydroxymethylierung berücksichtigen, ähnlich genau schätzen wie solche, die nur 5mC-Marker (sog. „wahre 5mC- Methylierung“) berücksichtigen und Modelle, die dem Goldstandard zugrunde liegen (undifferenzierte 5mC+5hmC-Werte). Dies macht 5hmC in jedem Fall zu einem weiteren vielversprechenden Marker für die forensische Altersschätzung. Allerdings ließ sich keine signifikante Verbesserung der Schätzgenauigkeit erzielen, weshalb die zweite Hypothese nicht bestätigt werden konnte. Die 5hmC-Methylierungswerten der einzelnen CpG-Stellen zeigten schwache bis moderate Korrelationen mit dem chronologischen Alter. Die Literatur weist darauf hin, dass 5hmC genomweit besser mit dem Alter korreliert als 5mC und diese auch unterschiedliche Gene regulieren. Daraus lässt sich schließen, dass eventuell noch nicht die besten 5hmC-Marker für die Altersschätzung gefunden werden konnten. Methoden, die längere Sektionen des Genoms analysieren können, eignen sich besser für eine zukünftige Suche nach den besten Markern.
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2025-03-26
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Holländer, O. (2024). Analyse altersabhängiger Änderungen der DNA-Methylierung. https://doi.org/10.60848/12808
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570 Biology
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author = {Holländer, Olivia},
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