Identification and functional studies of two novel serine phosphorylation sites of insulin receptor substrate (IRS)-2: Ser 675 and Ser 907

Abstract

Insulin receptor substrate (IRS) proteins are major transducers of the insulin and IGF-1 signal into the PI-3 kinase/PKB and the MAP kinase pathway. In addition to tyrosine phosphoryla-tion, a large number of serine/threonine phosphorylation sites enable the IRS proteins to inte-grate different extra- and intracellular stimuli resulting in positive and negative modulation of the insulin and IGF-1 signal. Chronic hyperphosphorylation of serine/threonine sites of IRS-1 is involved in the development of insulin resistance. IRS-2 is of great importance for β-cell survival and for the regulation of hepatic metabolism. The study of serine/threonine phos-phorylations is required to understand the physiological and pathophysiological regulation of this important mediator of insulin signaling. In this thesis two novel IRS-2 serine phosphoryla-tion sites have been identified and characterized (mouse amino acid numbering): Ser 675, which is located in the kinase regulatory loop binding (KRLB) domain unique to IRS-2 and Ser 907, which is adjacent to the Grb2 binding site Tyr 911. Using phospho-site specific antibod-ies both sites were demonstrated to be phosphorylated upon insulin, phorbol ester and ani-somycin treatment in Fao rat hepatoma cells. The phosphorylation was also detected in pri-mary human hepatocytes and in liver tissue of insulin treated or refed mice. The insulin-induced phosphorylation of Ser 907 was mediated by the MAP kinase ERK1/2. Simulation of a permanent phosphorylation of this site in BHK cells expressing IRS-2 Glu 907 led to a slight decrease of IRS-2 tyrosine phosphorylation with no apparent effect on insulin downstream signaling. The insulin-induced association of IRS-2 with Grb2 in HEK293 cells was abrogated by mutation of the adjacent Tyr 911 to Phe, but not influenced by mutation of Ser 907 to Ala. Of note, the activation of MAP kinase signaling was not impaired in HEK293 cells expressing IRS-2 Phe 911 and not regulated by the expression level of IRS-2 wildtype, but completely dependent on IR expression, indicating the importance of an alternative, IRS-2-Grb2-independent pathway for the activation of MAP kinase signaling in these cells. The insulin-induced phosphorylation of Ser 675 was dependent on mTOR, but not on the downstream kinase p70 S6K1. Prevention of this phosphorylation in BHK cells or HEK293 cells expressing IRS-2 Ala 675 had no effect on proximal or distal insulin signal transduction. But compared with IRS-2 wildtype, the mutated IRS-2 protein Ala 675 showed increased half life in cycloheximide-treated HEK293 cells. Thus, phosphorylation of Ser 675 could have a similar function as its homologous site Ser 632 in IRS-1 and could be involved in the regula-tion of mTOR-dependent IRS-2 proteasom-mediated protein degradation.

Die Insulin Rezeptor Substrate (IRS) sind bedeutende Vermittler des Insulin- und des IGF-1-Signales in den PI-3 Kinase- und den MAP Kinase-Signaltransduktionsweg. Zusätzlich zu Tyrosinphosphorylierungen ermöglichen eine große Anzahl an Serine/Threonin-Phosphorylierungsstellen der IRS-Proteine die Integration von verschiedenen extra- und in-trazellulären Stimuli was zu einer positiven und negativen Modulation des Insulin- und IGF-1 Signales führt. Chronische Hyperphosphorylierungen der Serin/Threonin-Reste des IRS-1 sind an der Entstehung von Insulinresistenz beteiligt. IRS-2 hat eine besondere Bedeutung für das Überleben der β-Zellen sowie für die Regulation des hepatischen Metabolismus. Die Untersuchung der Serin/Threonin-Phosphorylierungen ist die Voraussetzung um die physio-logische und pathophysiologische Regulation dieses wichtigen Vermittlers des Insulinsignales zu verstehen. In dieser Doktorarbeit wurden zwei neue IRS-2 Phosphorylierungsstellen identi-fiziert und charakterisiert (Maus IRS-2 Aminosäure Nummerierung): Ser 675, das in der IRS-2-spezifischen kinase regulatory loop binding (KRLB) Domäne liegt und Ser 907, das in der Nähe eines Grb2-Bindungsmotives (Tyr 911) liegt. Mit phospho-site-spezifischen Antikörpern wurden beide Phosphorylierungen in Fao Ratten Hepatoma-Zellen nach Insulin-, Phorbo-lester- und Anisomycinstimulation nachgewiesen. Die Phosphorylierungen wurden auch in primären humanen Hepatocyten sowie in Lebergewebe von insulinbehandelten oder gefütter-ten Mäusen detektiert. Die insulininduzierte Phosphorylierung von Ser 907 wurde durch die MAP Kinase ERK1/2 vermittelt. Die Simulation einer permanenten Phosphorylierung dieses Serinrestes in BHK-Zellen, die IRS-2 Glu 907 transient exprimierten, führte zu einer leichten Abnahme der IRS-2-Tyrosinphosphorylierung hatte aber keinen offensichtlichen Einfluss auf die nachgeordneten Insulin-Signaltransduktionskaskaden. Die insulininduzierte Bindung von Grb2 an IRS-2 war in HEK293 Zellen durch Mutation des benachbarten Tyrosin 911 zu Phenylalanin aufgehoben, wurde jedoch durch eine Mutation von Serin 907 zu Alanin nicht beeinflusst. Die Aktivierung des MAP Kinase Signalweges in IRS-2 Phe 911-überexprimierenden HEK293 Zellen war jedoch nicht beeinträchtigt und war auch nicht induziert durch die Überexpression des Wildtyp IRS-2. Allerdings war die Aktivierung dieses Signalweges vollständig abhängig von der Höhe der Insulinrezeptor-Expression, was auf einen alternativen, IRS-2-Grb2-unabhängigen Sig-nalweg bei der Aktivierung der MAP Kinase hindeutet. Die insulininduzierte Phosphorylierung von Ser 675 war abhängig von mTOR, jedoch nicht von seiner nachgeschalteten Kinase p70 S6K1. Die nicht-phosphorylierbare Ser 675 Ala Mutante, exprimiert in BHK und HEK293 Zellen, hatte keinen Einfluss auf die proximale oder distale Insulin-Signalweiterleitung. Allerdings hatte das mutierte IRS-2 675 Ala Protein eine verlängerte Halbwertszeit in Cycloheximid-behandelten HEK293 Zellen. Die Phosphorylie-rung von Ser 675 könnte daher eine ähnlich Funktion haben wie das homologe Ser 632 im IRS-1 und an der mTOR-abhängigen proteasomalen IRS-2 Proteindegradation beteiligt sein.