Charakterisierung der antimikrobiellen Aktivität von High-mobility group box 2

Abstract

The human body is continuously exposed to an enormous amount of microbes. Especially surfaces like the skin or the gastrointestinal mucosa are in close contact with large numbers of microorganisms, including bacteria, fungi and viruses. A very effective innate immune system protects the intestinal mucosa from an overgrowth of commensal bacteria and penetration by pathogenic microbes. Besides an efficient layer of thick mucus, antimicrobial peptides and proteins (AMPs) which can inhibit the growth of microorganisms or even destroy them are an essential part of the epithelial barrier. In 2009, as a part of my diploma thesis, I could show that high-mobility group box 2 (HMGB2) exhibits antimicrobial activity against E. coli. The aim of this PhD thesis was to characterize and further clarify this new function. HMGB2 was recombinantly expressed and systematically analyzed for antimicrobial activity. Notably, several gram-negative and gram-positive bacteria of the normal gut flora were critically affected by HMGB2. In addition, bactericidal properties against the pathogenic bacterial strain Staphylococcus aureus were detected via electron microscopic analysis. Furthermore potential influences of intestinal environmental conditions on the activity of HMGB2 were investigated. Changes in the pH or the generation of a reducing environment altered the activity of the protein only to a small amount. To localize the part of HMGB2 which is essential for its antimicrobial activity, three peptides which represent three regions of the protein were recombinantly expressed. An activity screening with the three peptides showed that the two DNA-binding-domains HMG-Box A and B are crucial for the antimicrobial effects. An expression study showed that HMGB2 is present in all analyzed stomach and intestinal sections. In addition, the expression in patients with inflammatory bowel disease (IBD) was studied. No significant differences between patients with Crohn?s disease, ulcerative colitis and unaffected controls were detected. However, the examination of stool from individuals of these three groups suggests that HMGB2 might be useful as a new marker for intestinal inflammation. In summary, HMGB2 exhibits antimicrobial activity against various commensal bacteria of the normal gut flora and is expressed in all analyzed gastrointestinal tract sections. HMGB2 is part of the intestinal barrier and protects, together with other AMPs, the intestine from microorganisms.

Der menschliche Organismus ist kontinuierlich großen Mengen an Mikroorganismen ausgesetzt. Besonders die Oberflächen, wie die Haut und die Mukosa des Gastrointestinaltraktes kommen in engen Kontakt mit einer Vielzahl unterschiedlicher Bakterien, Viren und Pilze. Das besonders stark ausgeprägte Immunsystem des Darms schützt die Mukosa vor einer Überwucherung mit kommensalen Bakterien und dem Eindringen von Pathogenen. Neben einer effektiven Barriere durch Mukus spielen antimikrobielle Proteine und Peptide (AMPs) eine entscheidende Rolle in der Verteidigung gegen Mikroorganismen, indem sie das Wachstum dieser einschränken oder sie sogar abtöten. Im Jahr 2009 konnte ich im Rahmen meiner Diplomarbeit nachweisen, dass High-mobility group box 2 (HMGB2) antimikrobielle Aktivität gegen E. coli besitzt. In dieser Doktorarbeit wurde die neue Funktion des HMGB2 genauer charakterisiert. Das Protein wurde dazu rekombinant hergestellt und zeigte Aktivität gegen verschiedene grampositive und gramnegative Bakterien der normalen Darmflora. Zusätzlich konnte mit Hilfe von elektronenmikroskopischen Analysen gezeigt werden, dass HMGB2 das Wachstum von Staphylococcus aureus negativ beeinflusst und bakterizide Wirkung gegen dieses pathogene Bakterium besitzt. Darüber hinaus wurde der Einfluss der im Darm vorliegenden Umgebungsbedingungen auf die antimikrobielle Aktivität von HMGB2 untersucht. Durch Änderungen des pH-Werts und der Generierung eines reduzierenden Milieus konnten keine signifikanten Änderungen der Aktivität ermittelt werden. Die rekombinante Expression von drei Peptiden, die drei Abschnitten des Proteins entsprechen und dem anschließenden Aktivitätsscreening gegen E. coli konnte gezeigt werden, dass die beiden DNA-Bindedomänen (HMG-Box A und B) die Aktivität vermitteln. Eine Analyse der Expression im Gastrointestinaltrakt zeigte, dass HMGB2 in allen untersuchten Magen- und Darmabschnitten vorhanden ist. Darüber hinaus wurde die HMGB2-Expression bei Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen untersucht. Es konnten jedoch keine signifikanten Veränderungen zwischen Kontroll-, Morbus Crohn- und Colitis ulcerosa-Patienten festgestellt werden. Die Analyse von Stuhl der Patienten zeigte allerdings, dass HMGB2 in einem Teil der Proben detektiert werden konnte und eventuell als Marker für intestinale Entzündungen verwendet werden kann. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass HMGB2 antimikrobielle Aktivität gegen verschiedene kommensale Bakterien der normalen Darmflora besitzt und in allen untersuchten Abschnitten des Magen-Darm-Trakts exprimiert wird. HMGB2 ist Bestandteil der Darmbarriere und gemeinsam mit anderen AMPs an der Abwehr von Mikroorganismen beteiligt.