Characterization of the role of the NLR proteins NLRC5 and NLRP11 in the immune response

Abstract

Recognition of conserved molecular patterns by pattern recognition receptors (PRRs) is crucial for the initiation of an innate immune response. Within PRRs, the NOD-like receptor (NLR) family is, in humans, a group of 22 cytosolic proteins, which function as PRRs of the innate immune system and as regulators of adaptive immune responses. However, it has become evident, that several NLR proteins also function as regulators of innate immune responses. In this thesis the function of human NLR proteins NLRC5 and NLRP11 in immune responses was further characterized. The first part of this thesis was focused on the NOD-like receptor NLRC5. NLRC5 and major histocompatibility complex (MHC) class II transcriptional activator (CIITA) are the master regulators of MHC class I and II transcription, respectively. Both proteins can translocate into the nucleus, where they induce transcription of MHC class I and class II, respectively. As NLRC5 and CIITA do not possess intrinsic DNA binding capacities, they exert their function by binding to a common multiprotein complex, termed MHC enhanceosome and through recruitment of further transcriptional regulators. Although MHC enhanceosome components are, as known thus far, identical, NLRC5 and CIITA are specific for their respective transcriptional targets. In this work we employed several techniques to identify novel interaction partners of NLRC5 to understand the mechanisms behind this specificity. As the N-terminal domain death-domain like fold (DD) of NLRC5 has previously been shown to be involved in conferring specificity, we adapted a protocol for proximal ligation by fusion of the NLRC5 DD to biotin ligase from Aquifex aeolicus (BioID2) to unravel the interactome of this NLRC5 domain. By enrichment of biotinylated proteins through streptavidin-biotin precipitation and analysis of the proteins by LC-MS/MS, we aimed to identify novel putative interactors with functions in transcriptional regulation. Additionally, we used yeast 2 hybrid screening of the NLRC5 DD against a library of human CD4+ and CD8+ T cells for the identification of novel interaction partners. This led to the identification of the paired amphipathic helix protein Sin3A (Sin3A) and the negative elongation factor B (NELFB) as interactors of NLRC5 DD. Characterization of their role in transcriptional regulation of MHC class I revealed an inhibitory role of both proteins. However, as we also observed repression of CIITA-mediated MHC class II transcription, both proteins are likely not involved in determination of target specificity of NLRC5. Translocation of NLRC5 into the nucleus is essential for the induction of MHC class I transcription. It has however previously been shown, that forced nuclear localization of NLRC5 strongly diminishes its transcriptional activity. We therefore employed co-immunoprecipitation of differentially localized NLRC5 constructs to identify interaction partners which might be involved in post translational regulation of NLRC5. Further, to advance our understanding of the NLRC5 DD, we aimed to elucidate its crystal structure. For this, we established a protocol for large-scale recombinant expression and purification of the NLRC5 DD for subsequent crystallization of the recombinant protein. The second part of this thesis was focused on NLRP11. Tight regulation of inflammatory cytokine and interferon (IFN) production in innate immunity is pivotal for optimal control of pathogens and avoidance of immunopathology. NLRP11 has previously been shown to regulate type I IFN and other pro-inflammatory responses. To gain a deeper understanding of the underlying mechanism, we aimed to identify novel NLRP11 interactors, through which the inhibition is conferred. Here we generated cell lines stably expressing NLRP11-eGFP as novel tools to elucidate the functions of NLRP11. We identified the ATP-dependent RNA helicase DDX3X as a novel binding partner of NLRP11 by co immunoprecipitation and LC-MS/MS. DDX3X is known to enhance type I IFN responses and NLRP3 inflammasome activation. We demonstrate that NLRP11 can abolish IKKe-mediated phosphorylation of DDX3X, resulting in lower type I IFN induction upon viral infection. These effects were dependent on the leucine-rich repeat (LRR) domain of NLRP11 that we mapped as the interaction domain for DDX3X. In addition, NLRP11 also suppressed NLRP3-mediated caspase-1 activation in an LRR domain-dependent manner, suggesting, that NLRP11 might sequester DDX3X and prevent it from promoting NLRP3-induced inflammasome activation. Taken together, our data revealed DDX3X as a central target of NLRP11, which can mediate the effects of NLRP11 on type I IFN induction, as well as NLRP3 inflammasome activation. This expands our knowledge of the molecular mechanisms underlying NLRP11 function in innate immunity and suggests that both NLRP11 and DDX3X might be promising targets for modulation of innate immune responses.

Die Erkennung konservierter molekularer Muster durch Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) ist die Grundlage für die Einleitung einer angeborenen Immunreaktion. Innerhalb der Gruppe der PRRs stellen die NOD-like Rezeptoren (NLRs) im Menschen eine Gruppe von 22 zytosolischen Proteinen dar, welche Funktionen als PRRs, sowie in der Regulation der adaptiven Immunantwort besitzen. Einige NLR Proteine wurden ebenfalls als Regulatoren angeborener Immunreaktionen beschrieben. In dieser Arbeit wurde die Rolle der humanen NLR Proteine NLRC5 und NLRP11 in der Immunantwort weiterführend charakterisiert. Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit NLRC5. NLRC5 und der major histocompatibility complex class II transcriptional activator (CIITA) sind die Hauptregulatoren der Transkription der Haupthistokompatibilitätskomplexe (MHC) Klasse I respektive Klasse II. Beide Proteine translozieren in den Zellkern, binden jedoch nicht direkt an die DNA, sondern interagieren hierfür mit dem MHC Enhanceosom. Zusätzlich rekrutieren sie transkriptionelle Regulatoren. Obwohl die aktuell bekannten Komponenten des Enhanceosoms identisch sind, sind NLRC5 und CIITA spezifisch für ihre Zielgene. Um die zugrunde liegenden Mechanismen der Spezifität zu verstehen, verwenden wir hier verschiedene Methoden zur Identifikation neuer Interaktionspartner von NLRC5. Da in vorhergehenden Arbeiten gezeigt werden konnte, dass die N-terminale Domäne (DD) von NLRC5 für die Spezifität wichtig ist, wurden mittels Fusion der NLRC5 DD an die Biotinligase von Aquifex aeolicus (BioID2), Proteine in räumlicher Nähe des Fusionsproteins mit Biotin markiert, durch Streptavidin-Biotin Präzipitation aufgereinigt und anschließend mittels LC-MS/MS Analyse identifiziert. Dadurch sollten neue Interaktoren mit Funktionen in der transkriptionellen Regulation identifiziert werden. Des Weiteren wurden in einem Hefe 2 Hybrid Screenings der DD gegen eine Bibliothek aus humanen CD4+ und CD8+ T Zellen, das paired amphipathic helix Protein Sin3A (Sin3A), sowie der negative elongation factor B (NELFB) als Interaktoren identifiziert. Beide Proteine zeigten ein inhibitorische Funktion bei der NLRC5-vermittelten Induktion von MHC Klasse I, allerdings ebenfalls bei der CIITA-vermittelten MHC Klasse II Transkription. Beide Proteine sind deshalb wohl nicht in der Vermittlung der Spezifität von NLRC5 für MHC Klasse I involviert. Der Import von NLRC5 in den Zellkern ist essenziell für die MHC Klasse I Transkriptionjedoch vermindert erzwungene nukleäre Lokalisation die transkriptionelle Aktivität stark. Deshalb haben wir versucht, mittels Ko Immunopräzipitation (Ko-IP) unterschiedlich lokalisierter NLRC5-Konstrukte, Interaktoren zu identifizieren, die in der post-translationalen Kontrolle von NLRC5 involviert sind. Um des Weiteren unser Verständnis der N-terminalen Domäne von NLRC5 zu vertiefen, wurde die Untersuchung der Proteinstruktur der Domäne nach Kristallisation angestrebt. Hierzu wurde ein Protokoll zur rekombinanten Expression, sowie zur Aufreinigung des Proteins etabliert. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit NLRP11. Die effektive Regulation der inflammatorischen Zytokin- und Interferon (IFN)-Antworten des angeborenen Immunsystems ist essenziell, um Pathogenen unter Kontrolle zu halten, und dabei Immunopathologien durch überschießende Immunreaktionen zu vermeiden. In vorhergehenden Arbeiten wurde NLRP11 als negativer Regulator der Typ I IFN-Antwort, sowie anderer pro-inflammatorischer Immunantworten beschrieben. Um unser Verständnis der zugrunde liegenden regulatorischen Mechanismen zu vertiefen, haben wir mittels in dieser Arbeit generierten Zelllinien mit stabiler, induzierbarer Expression von NLRP11 eGFP, durch Ko-IP und LC-MS/MS nach neuen Interaktoren von NLRP11 gesucht, die dessen inhibitorische Funktion vermitteln. Hierbei haben wir die ATP-abhängige RNA-Helikase DDX3X identifiziert, die als positiver Regulator der Typ I IFN-Antwort und des NLRP3 Inflammasoms bekannt ist. Wir zeigen hier, dass NLRP11 die IKKe-vermittelte Phosphorylierung von DDX3X verhindert, was zur Verminderung der Typ I IFN-Antwort nach viraler Infektion führt. Dieser Effekt ist von der NLRP11 Leucin rich repeat (LRR) Domäne abhängig, die wir als Interaktionsdomäne für DDX3X identifizieren konnten. Zusätzlich zeigen wir, dass die NLRP11 LRRs die NLRP3-vermittelte Caspase-1 Aktivierung in Abhängigkeit von DDX3X inhibieren, was vermuten lässt, dass NLRP11 DDX3X sequestriert und damit verhindert, dass DDX3X die NLRP3 vermittelte Inflammasomaktivierung verstärkt. Unsere Daten zeigen, dass DDX3X ein zentraler Faktor für die negative Regulation der Typ I IFN-Antwort, sowie des NLRP3 Inflammasoms durch NLRP11 ist. Dies vertieft unser Wissen über die zugrunde liegenden Mechanismen der regulatorischen Funktion von NLRP11 in der angeborenen Immunantwort und weist darauf hin, dass sowohl NLRP11 als auch DDX3X vielversprechende Kandidaten für Eingriffe in das angeborene Immunsystem darstellen.