Impact of process parameters on the sourdough microbiota, selection of suitable starter strains, and description of the novel yeast Cryptococcus thermophilus sp. nov.

Abstract

The microbiota of a ripe sourdough consists of lactic acid bacteria (LAB), especially of the genus Lactobacillus, and yeasts. Their composition is influenced by the interplay of species or strains, the kind of substrate as well as the process parameters temperature, dough yield, redox potential, refreshment time, and number of propagation steps (Hammes and Gänzle, 1997). As taste and quality of sourdough breads are mainly influenced by the fermentation microbiota, intense research has been focused on determination of sourdough associated species and search for new starter cultures. In recent years, economic competition pressure and new consumer demands have led to steady research for new cereal products, especially with health benefit or for people suffering from celiac disease. For these reasons, alternative cereals like oat and barley (both toxic for celiac disease patients) as well as the celiac disease compatible cereals rice and maize, sorghum and millets, the pseudocereals amaranth, quinoa and buckwheat as well as cassava got into the focus of interest. However, information about the microbiota of sourdoughs fermented with buckwheat, amaranth, quinoa, oat or barley is not available except for the following recent studies: a study about the microbiota of amaranth sourdoughs by Sterr et al. (2009), a study about barley sourdough by Zannini et al. (2009), a study about oat sourdoughs by Huettner et al. (2010) and a study about buckwheat and teff sourdoughs by Moroni et al. (2011). The microbiota of sourdoughs from the other mentioned cereals as well as cassava was multiply characterised but not systematically. Fermentation conditions were partly not clearly defined, and identification of species was often based on physiological criteria only, known to be insufficient for the exact classification of LAB. Thus, in this thesis, the influence of the process parameters substrate, temperature, refreshment time, amount of backslopping dough as well as the interplay between the different species or strains were examined and potential starter strains were selected. In Chapter III, the effect of the substrate on the sourdough microbiota was examined and suitable starter cultures for fermentation of non-bread cereals and pseudocereals were selected. Eleven different flours from wheat, rye, oat, barley, millet, rice, maize, amaranth, quinoa, buckwheat and cassava were inoculated with a starter mixture containing numerous LAB and yeasts. Sourdoughs were fermented at 30 °C and refreshed every 24 hours until the microbiota was stable. Species were identified by PCR-DGGE as well as bacteriological culture and RAPD-PCR, followed by 16S/26S rRNA sequence analysis. In these fermentations, the dominant yeast was Saccharomyces cerevisiae; Issatchenkia (I.) orientalis was only competitive in the quinoa and the maize sourdough. No yeasts were found in the buckwheat and the oat sourdough. The dominant LAB species were Lactobacillus (L.) paralimentarius in the pseudocereal sourdoughs, L. fermentum, L. helveticus and L. pontis in the cereal sourdoughs, and L. fermentum, L. plantarum and L. spicheri in the cassava sourdough. Competitive LAB and yeasts were inserted as starters for a further fermentation using new flours from rice, maize, millet and the pseudocereals. After ten days of fermentation, most of the starter strains were still dominant, but L. pontis and L. helveticus could not compete with the other species. It is remarkable that from the numerous starter strains which all were adapted to or isolated from sourdoughs, only a few were competitive in these fermentations; but if, then in most cases in a lot of different flours. In Chapter IV, the effects of the exogenous process parameters substrate, refreshment time, temperature, amount of backslopping dough as well as competing species on the two microbial associations L. sanfranciscensis ? Candida (C.) humilis and L. reuteri ? L. johnsonii ? I. orientalis were examined. Both associations had previously been found to be competitive in sourdough (Kline and Sugihara, 1971a; Nout and Creemers-Molenaar, 1987; Gobbetti et al., 1994a; Garofalo et al., 2008; Böcker et al., 1990; Meroth et al., 2003a). 28 sourdough batches were fermented under defined conditions until the microbiota was stable. Dominant LAB and yeasts were characterized by bacteriological culture, RAPD-PCR and 16S/26S rRNA gene sequence analysis. The process parameters for the association L. sanfranciscensis ? C. humilis could be defined as follows: rye bran, rye flour or wheat flour as substrate, temperatures between 20 and 30 °C, refreshment times of 12 to 24 hours and amounts of backslopping dough from 5 to 20 %. In addition, the association was predominating against all competing lactic acid bacteria and yeasts. The association L. reuteri ? L. johnsonii ? I. orientalis was competitive at temperatures of 35 to 40 °C, refreshment times of 12 to 24 hours and the substrates rye bran, wheat flour and rye flour, but only with sufficient oxygen supply. Cell counts of I. orientalis fell rapidly under the detection limit when using high amounts of doughs (small ratio of surface to volume) and refreshment times of 12 hours. The fermentations depicted in Chapter III and IV give new information about the influence of process parameters on the sourdough microbiota. The studies show that the sourdough microbiota is markedly influenced by the process parameters and kind and quality of substrate. The competitiveness of a single LAB or yeast is strain specific. Interactions between microorganisms also play an important role. However, for the search for suitable starter strains, it would be beneficial to know the reasons, why a single LAB or yeast strain is better adapted to specific process parameters or substrates than others. One of the starter sourdoughs used for fermentation I described in Chapter III was a sourdough made from cassava flour, inoculated with several LAB. No yeast had been inserted, but several yeasts were isolated from the ripe sourdough, which are supposed to originate from the cassava flour. An unknown yeast species constituted 10 % of the isolated yeasts which is described as novel species Cryptococcus thermophilus sp. nov. in Chapter V. This yeast is characterized by budding on small neck-like structures, no fermentative ability, growth at 42 °C and without vitamins, a major ubiquinone of Q-10, as well as the production of green or blue fluorescent substances in the growth medium. It is distinct from related species by the ability to assimilate raffinose and cadaverine, the inability to assimilate soluble starch, xylitol, galactitol, butane-2,3-diol, sodium nitrite and lysine, and the inability to produce starch-like substances. The closest relatives are the yeasts belonging to the Cryptococcus humicola complex.

Die Mikroflora eines reifen Sauerteiges besteht aus Milchsäurebakterien, insbesondere des Genus Lactobacillus, und Hefen. Ihre Zusammensetzung wird beeinflusst durch die Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Spezies bzw. Stämmen, die Art des Substrats sowie die Prozessparameter Temperatur, Teigausbeute, Redoxpotential, Führungsdauer und Zahl der Propagationsschritte (Hammes und Gänzle, 1997). Da Geschmack und Qualität von Sauerteigbroten maßgeblich durch die Fermentationsflora beeinflusst werden, konzentriert sich die Forschung auf die Identifizierung sauerteigassoziierter Spezies und die Suche nach neuen Starterkulturen. In den letzten Jahren führten wirtschaftlicher Konkurrenzdruck und neue Verbraucherwünsche zur stetigen Entwicklung neuer Zerealienprodukte, insbesondere mit gesundheitlichem Nutzen oder für Menschen, die unter Zöliakie leiden. Aus diesen Gründen erlangten alternative Getreidearten wie Hafer und Gerste (beide zöliakietoxisch) sowie die zöliakieverträglichen Getreidearten Reis und Mais, Hirsearten, die Pseudozerealien Amaranth, Quinoa und Buchweizen und auch Maniok Interesse. Informationen über die Mikroflora von Sauerteigen aus Buchweizen, Amaranth, Quinoa, Hafer oder Gerste sind allerdings nicht erhältlich außer den folgenden kürzlich erschienenen Studien: eine Studie über die Mikroflora von Amaranthsauerteigen von Sterr et al. (2009), eine Studie über Gerstensauerteig von Zannini et al. (2009), eine Studie über Hafersauerteige von Huettner et al. (2010) und eine Studie über Buchweizen- und Teffsauerteige von Moroni et al. (2011). Die Sauerteigmikroflora der übrigen oben erwähnten Zerealien sowie Maniok wurde vielfach charakterisiert, jedoch nicht systematisch. Teilweise wurden die Fermentationsbedingungen nicht klar aufgeführt, und die Identifikation der Spezies basierte oft nur auf physiologischen Kriterien, was bekanntermaßen für die exakte Bestimmung von Milchsäurebakterien nicht ausreicht. In dieser Arbeit wurden daher die Einflüsse der Prozessparameter Substrat, Temperatur, Führungsdauer, Menge des Anstellguts sowie Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Spezies bzw. Stämmen auf die Sauerteigmikroflora untersucht und potentielle Starterstämme selektiert. In Kapitel III wurden die Auswirkungen des Substrats auf die Sauerteigmikroflora untersucht sowie geeignete Starterkulturen für die Fermentation von Nichtbrotgetreidearten und Pseudozerealien selektiert. Elf verschiedene Mehle aus Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Millet, Reis, Mais, Amaranth, Quinoa, Buchweizen und Maniok wurden mit einer Startermischung inokuliert, die eine Vielzahl von Milchsäurebakterien und Hefen enthielt. Die Sauerteige wurden bei 30 °C fermentiert und alle 24 Stunden neu angefrischt, bis die Mikroflora stabil war. Spezies wurden mittels PCR-DGGE sowie mit bakteriologischer Kulturtechnik und RAPD-PCR gefolgt von 16S/26S rRNA-Sequenzanalyse identifiziert. In diesen Fermentationen war Saccharomyces cerevisiae die dominierende Hefe; Issatchenkia (I.) orientalis war nur im Quinoa- und im Maissauerteig wettbewerbsfähig. Im Buchweizen- und im Hafersauerteig wurden keine Hefen gefunden. Die dominanten Milchsäure¬bakterienspezies waren Lactobacillus (L.) paralimentarius in den Pseudozerealiensauerteigen, L. fermentum, L. helveticus und L. pontis in den Zerealiensauerteigen sowie L. fermentum, L. plantarum und L. spicheri im Manioksauerteig. Wettbewerbsstarke Milchsäurebakterien und Hefen wurden als Starter für eine weitere Fermentation eingesetzt, wobei neue Mehle aus Reis, Mais, Millet und den Pseudozerealien verwendet wurden. Nach zehntägiger Fermentation waren die meisten der Starterstämme noch dominant, jedoch konnten L. pontis und L. helveticus nicht mit den anderen Spezies mithalten. Es ist bemerkenswert, dass von den zahlreichen Starterstämmen, die alle an Sauerteig adaptiert waren oder aus Sauerteigen isoliert wurden, nur einige wenige in diesen Fermentationen wettbewerbsstark waren; aber wenn, dann meist in vielen verschiedenen Mehlen. In Kapitel IV wurden die Auswirkungen der exogenen Prozessparameter Substrat, Führungsdauer, Temperatur, Menge des Anstellguts sowie konkurrierender Spezies auf die beiden mikrobiellen Gemeinschaften L. sanfranciscensis ? Candida (C.) humilis und L. reuteri ? L. johnsonii ? I. orientalis untersucht. Beide Gemeinschaften wurden im Vorfeld als wettbewerbsfähig im Sauerteig befunden (Kline und Sugihara, 1971a; Nout und Creemers-Molenaar, 1987; Gobbetti et al., 1994a; Garofalo et al., 2008; Böcker et al., 1990; Meroth et al., 2003a). 28 Sauerteigansätze wurden unter definierten Bedingungen fermentiert, bis die Mikroflora stabil war. Dominante Milchsäurebakterien und Hefen wurden mit bakterio-logischer Kulturtechnik, RAPD-PCR und 16S/26S rRNA-Gen-Sequenzanalyse identifiziert. Die Prozessparameter für die Gemeinschaft L. sanfranciscensis ? C. humilis konnten folgendermaßen definiert werden: Roggenkleie, Roggen- oder Weizenmehl als Substrat, Temperaturen zwischen 20 und 30 °C, eine Führungsdauer von 12 bis 24 Stunden und eine Anstellgutmenge von 5 bis 20 %. Zudem war die Gemeinschaft vorherrschend gegen alle konkurrierenden Milchsäurebakterien und Hefen. Die Gemeinschaft L. reuteri ? L. johnsonii ? I. orientalis war wettbewerbsfähig bei Temperaturen zwischen 35 und 40 °C, Führungs¬zeiten von 12 bis 24 Stunden und mit den Substraten Roggenkleie, Roggen- oder Weizen¬mehl, jedoch nur bei ausreichender Sauerstoffversorgung. Die Zellzahlen von I. orientalis fielen bei großen Teigmengen (geringes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen) und Führungszeiten von 12 Stunden rasch unter die Nachweisgrenze. Die Fermentationen aus Kapitel III und IV geben neue Informationen über die Auswirkungen von Prozessparametern auf die Sauerteigmikroflora. Die Studien zeigen, dass die Sauerteigmikroflora durch die Prozessparameter und die Art und Qualität des Substrats ausgesprochen beeinflusst wird. Die Wettbewerbsfähigkeit eines einzelnen Milchsäure-bakteriums oder einer Hefe ist stammspezifisch. Auch Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen spielen eine bedeutende Rolle. Jedoch wäre es für die Suche nach passenden Starterstämmen von Vorteil, die Gründe zu kennen, warum ein einzelner Milchsäurebakterien- oder Hefestamm besser an spezifische Prozessparameter oder Substrate angepasst ist als andere. Einer der Startersauerteige für die Fermentation I in Kapitel III war ein Sauerteig aus Maniokmehl, inokuliert mit verschiedenen Milchsäurebakterien. Es wurde keine Hefe eingesetzt, jedoch wurden mehrere Hefen aus dem reifen Sauerteig isoliert, welche wahrscheinlich aus dem Maniokmehl stammen. 10 % der isolierten Hefen stellte eine unbekannte Hefespezies dar, welche als neue Spezies Cryptococcus thermophilus sp. nov. in Kapitel V beschrieben wird. Diese Hefe ist charakterisiert durch Knospung an kurzen halsartigen Fortsätzen, Wachstum bei 42 °C und ohne Vitamine, Q-10 als Hauptubichinon sowie die Produktion von grün oder blau fluoreszierenden Substanzen im Wachstumsmedium. Sie unterscheidet sich von verwandten Spezies durch die Fähigkeit zur Assimilation von Raffinose und Cadaverin, die Unfähigkeit zur Assimilation löslicher Stärke, Xylitol, Galactitol, Butan-2,3-diol, Natriumnitrit und Lysin und die Unfähigkeit zur Bildung stärkeähnlicher Substanzen. Die nächsten Verwandten sind die Hefen des Cryptococcus humicola-Komplexes.