Physiological, molecular, and epigenetic aspects of early transient nitrogen deprivation recovery in maize

Abstract

Maize is a widely cultivated crop and a primary food source for humans and livestock. Along with its substantial contribution to biomass for fuel production, maize is the most produced cereal globally. However, despite its prevalence, improving nitrogen (N) use efficiency in maize presents ongoing challenges. Understanding how maize plants utilize nitrogen is crucial for identifying traits that could aid breeders in addressing this efficiency gap. When plants experience transient stress and return to previous conditions, a recovery phase is initiated, acclimating the plants and potentially enhancing their responses to subsequent stress events. This mild or transient stress is termed "eustress," and its intentional manipulation is referred to as "crop priming." Crop priming, extensively studied in the context of drought, was explored in our previous research, which revealed that nitrogen supplementation during recovery from early transient water deficits enhances priming effects. This highlights the pivotal role of N in priming and that impaired N supply might negatively affect any acclimation to future stresses. Notably, there is limited literature on transient N deprivation, with most studies focusing on plant responses under conditions of maintained N deficiency. Furthermore, epigenetic regulation of plant mineral nutritional responses via DNA methylation has been reported, like many aspects of plant development that are regulated by such mechanism. Epigenetics is the study of phenotypic changes that can be inherited through mitosis or meiosis, which cannot be explained by changes in the DNA sequence. DNA methylation is the covalent modification of cytosines by the addition of a methyl group, which, depending on its location in the genome, can affect genomic stability and gene expression. Previous results have revealed that N deficiency modifies the methylome of maize roots, hypomethylating transposable elements in a nutrient-specific way. Weak correlations between DNA methylation and gene expression were observed, but a deeper insight into how this covalent modification of cytosines is related to plant mineral nutrition is lacking. DNA methylation patterns are heritable in a sort of “epigenetic memory” and may arise after an environmental stimulus. Here, the role of DNA methylation and its relationship with physiological responses during transient N deprivation were studied. The Fast-Flowering Mini-Maize inbred line A (FFMM-A) was chosen for this study because it can be easily grown hydroponically under controlled conditions. Maize ear leaves recovering from initial nitrogen deprivation (without water limitation) exhibited tissue-specific differences in rapidly dividing meristematic and mature photosynthetically active tissues. Through a series of experiments, a 60 h N deprivation period at the V1 stage was established as a nutritional stress that allowed plants to show mild N deprivation symptoms from which the plants fully recovered. Kinematic analysis of the recovering ear leaf revealed a slight decrease in leaf blade length due to reduced leaf meristem size and leaf number, resulting in a reduced cell production rate. Interestingly, the leaf elongation rate (LER) was maintained, causing a higher specific leaf area, which affected the leaf blade structure. Transcriptomic analysis of the cell division and maturation zones of the recovering ear leaf showed altered gene expression related to cell cycle, lipid metabolism, and secondary metabolism, including phytohormone regulation. Notably, cell cycle-related proteins are also involved in DNA repair and may be involved in somatic memory effects. If plants that had been exposed to early transient N-deficiency stress were later subjected to a second N-deprivation stress at the V5 stage, physiological measurements showed that early N deprivation affected upper leaf chlorophyll accumulation during late N-deprivation recovery. These findings suggest that early N deprivation has long-term effects, especially in dividing tissues, from which young and mature tissues are produced by replication. Furthermore, I identified that the loss of DNA methylation makes maize plants more susceptible to early N deprivation. Loss-of-function zmet2 allele was used in this study. Examination of the methylome of the zmet2 and zmet5 mutants provided insights into the relationship between DNA methylation patterns, nitrogen responses, and the expression of developmentally regulated genes in the leaf. These alleles correspond to CHROMOMETHYLASE3-like maintenance methyltransferase genes, and their mutation causes generalized genome hypomethylation, mostly in the CHG and CHH contexts. After a 96 h N deprivation period at the V1 stage, the zmet2 mutants failed to modify their root-to-shoot ratio and to maintain the LER, with respect to the isogenic B73 line. Moreover, machine learning identified interesting clusters according to their expression patterns from the leaf transcriptome of the dividing and maturation zones of FFMM-A plants. Reanalysis of publicly available datasets from B73 seedling leaf methylation patterns and those of the zmet2 and zmet5 mutants was used to compare the expression patterns of the gene clusters, their methylation patterns, and selected genome features. Interestingly, the methylation pattern of the gene body was highly correlated with the level of expression in the dividing zone of the developing ear leaf. Collectively, mutants in the methylation maintenance pathway, rather than being susceptible to N deprivation, failed to develop symptoms of recovery from such stress, which might be related to the regulation of N metabolism-related genes by DNA methylation. Additionally, the closely related gene expression pattern in the dividing zone and intron non-CpG methylation suggests an intimate role of maintenance of DNA methylation in N nutrition.

Mais ist eine Hauptnahrungsquelle für Menschen und Nutztiere. Zusätzlich macht sein erheblicher Beitrag zur Biomasse für die Brennstoffproduktion dieses Getreide zu den am meisten produzierten Nutzpflanzen weltweit. Wegen seiner globalen Nutzung und weltweiten Bedeutung steht die Verbesserung der Stickstoffnutzungseffizienz im Zentrum der Forschung. Generell sollte das physiologische und genetische Verständnis der Stickstoffnutzung im Mais Züchtern Merkmale liefern, um die Nährstoffeffizienz zu steigern. In den meisten Umwelten sind Nutzpflanzen vielen Stressbedingungen transient ausgesetzt, welche gleichzeitig oder aufeinanderfolgend auftreten können. Ist der Stress mild und nur vorübergehend, erholen sich die Maispflanzen recht zügig. Inwieweit die Stressreaktionen der Pflanzen auf nachfolgende Stressereignisse sogar verbessert werden, ist unklar. Ein milder oder vorübergehender Stress wird als "Eustress" bezeichnet, und kann zum "Crop Priming" führen. Crop Priming wurde detailliert im Zusammenhang mit Trockenstress untersucht und kann durch eine Stickstoffgabe während der Erholungsphase positiv beeinflusst werden. Dies legt eine entscheidende Rolle von Stickstoff beim Priming nahe und könnte bedeuten, dass eine Beeinträchtigung der Stickstoffversorgung die Akklimatisierung an den Stress und die Erholungsphase negativ beeinflussen könnte. Effekte von vorübergehendem Stickstoffmangel sind bisher wenig untersucht, in den meisten Studien werden Langzeitwirkungen von anhaltendem Stickstoffmangel untersucht. So wie die Pflanzenentwicklung von der Keimung zur Organspezifizierung epigenetisch reguliert ist, sind auch Aspekte der mineralischen Ernährung von Pflanzen durch DNA-Methylierung beeinflusst. Die Epigenetik untersucht Ausprägungen oder Veränderungen im Phänotyp einer Pflanze die durch Mitose oder Meiose vererbt werden können, die aber nicht durch Veränderungen in der DNA-Sequenz erklärt werden können. Die DNA-Methylierung ist dabei die kovalente Modifikation von Cytosinen durch die Hinzufügung einer Methylgruppe. Je nach Position im Genom kann dies die genomische Stabilität und/oder die Genexpression beeinflussen. Frühere Ergebnisse zeigten, dass Stickstoffmangel die Gesamtverteilung der Methylreste an spezifischen Cytosinen in Maiswurzeln modifiziert. Insbesondere werden Transposons bei bestimmten Nährstoffmängeln hypomethyliert. Schwache Korrelationen zwischen DNA-Methylierung und Genexpression deuten auf nährstoffspezifische Zusammenhänge hin. Da DNA-Methylierungsmuster durch Umweltreize verändert werden können, ist es möglich, dass diese in einer Art "epigenetischem Gedächtnis" vererbt werden. Hier wurde gefunden, dass eine Maispflanze, die sich von anfänglichem Stickstoffmangel erholt, bleibende Veränderungen in ihrem Lebenszyklus zeigt. Ein vorübergehender früherer Stickstoffmangelstress kann sich als Priming auf einen späteren Stickstoffmangel auswirken. Die früh blühende Mini-Mais Inzuchtlinie A (FFMM-A) wurde für diese Studie ausgewählt, da diese sich leicht hydroponisch unter kontrollierten Bedingungen anziehen lässt. Eine 60-stündige Stickstoffentzugperiode im V1-Stadium rief milde Mangelsymptome hervor, von der sich die Pflanze vollständig erholen konnte. Die kinematische Analyse des Fahnenblatts zeigte eine leichte Abnahme der Blattlänge aufgrund einer verringerten Meristemgröße und Zellzahl, was zu einer reduzierten Zellproduktionsrate führte. Interessanterweise wurde die Blattverlängerungsrate (LER) aufrechterhalten, was zu einer höheren spezifischen Blattfläche führte und die Blattblattstruktur beeinflusste. Eine Transkriptomanalyse der Zonen der Zellteilung und von vollständig differenziertem Blattgewebe zeigte eine veränderte Genexpression für Gene des Zellzyklus, des Lipidstoffwechsels, des Sekundärstoffwechsels und deutete auf veränderte Phytohormonregulation hin. Proteine, die mit dem Zellzyklus zusammenhängen, sind auch an der DNA-Reparatur beteiligt. Inwieweit sich Gewebe somatisch an früheren Stickstoffmangel erinnern konnte, wurde mit einem weiteren Experiment getestet. Pflanzen die zuvor transientem Stickstoffmangel ausgesetzt waren, wurden dazu später im V5-Stadium erneut einem Stickstoffmangel ausgesetzt. Physiologische Messungen zeigten, dass ein früherer transienter Stickstoffmangel erinnert wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass früher Stickstoffentzug langfristige Auswirkungen hat und dass Enzyme der DNA-Reparatur an der Anpassung beteiligt sind. Inwieweit DNA Methylierung im Mais beim Erholen von Stickstoffmangelstress eine Rolle spielt wurde in zmet2 Mutanten untersucht, in denen das Genom hypomethyliert ist. Methylome der zmet2- und zmet5-Mutanten lieferten Einblicke in die Beziehung zwischen DNA-Methylierungsmustern und der Expression entwicklungsregulierter Gene im Blatt. ZMET2 und ZMET5 Allele entsprechen den Genen für CHROMOMETHYLASE3-ähnliche Instandhaltungsmethyltransferasen, und loss-of-function Mutanten haben Defekte im CHG- und CHH-Kontext bei Mais. Nach 4 Tagen ohne Stickstoff im V1-Stadium konnten zmet2-Mutanten im Vergleich zur isogenen B73-Linie ihr Wurzel-Schuss-Verhältnis nicht modifizieren und die Blattstreckung nicht aufrechterhalten. In Transkriptomen der Differenzierungszone und von ausdifferenziertem Blatt wurden unter Verwendung von maschinellem Lernen Cluster von Genen identifiziert, die sich ähnlich verhalten. Mittels öffentlich verfügbarer Datensätze von B73 und denen von zmet2- und zmet5-Mutanten wurden interessante Zusammenhänge von Expressions- und Methylierungsmustern identifiziert. Methylierungsdefiziente Mutanten konnten sich insbesondere schlechter in der Erholungsphase nach dem Stickstoffmangel regenerieren. was mit der Regulation von Genen für Stickstoffmetabolismus durch DNA-Methylierung zusammenhängen könnte. Darüber hinaus legen der enge Zusammenhang des Genexpressionsmusters in der Zellteilungszone mit bestimmten Genmerkmalen bei der Erholung von Stress eine enge Rolle der Erhaltungs-DNA-Methylierung in der N-Ernährung nahe.