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Doctoral Thesis
2008
Deskriptive und funktionelle Analyse der Mitglieder der Calponin-Genfamilie Xclp1, Xclp2 und Xclp3 während der Embryonalentwicklung von Xenopus laevis
Deskriptive und funktionelle Analyse der Mitglieder der Calponin-Genfamilie Xclp1, Xclp2 und Xclp3 während der Embryonalentwicklung von Xenopus laevis
Abstract (English)
The embryonic development of vertebrates is characterized by controlled cell movements. During gastrulation and neurulation cells of the presumptive heart tissue and the neural crest after neural tube closure migrate towards their final position in the embryo. Cell intercalations, which drive the convergent extension (CE) movements to elongate the embryo also depend on active cell migration. The inhibition of CE leads to shortened body axis and neural tube closure defects (NTD).
The motility of eukaryotic cells is finally based on the dynamic interaction of cytoskeletal components, which act on the actin filament. Secreted growthfactors of the Wnt family can regulate embryonic cell movement via the non canonical Wnt signaling pathways. The planar cell polarity (PCP) and the Wnt/Ca2+ pathway are thought to be crucial for the process of CE. Up to now there is a lack of knowledge about the cytoskeletal effectors of these signaling cascades. In the presented work, members of the calponin gene family
(clp1 to 3) were analysed in this context. Calponins are actin binding proteins, which have been shown to inhibit actin-myosin-interactions and/or to stabilize the actin filament. Expression patterns provided first insights in the transcriptional activity of Xclp1, Xclp2 and Xclp3 during embryonic development. Two Xclp genes (Xclp2 and Xclp3) were already expressed broadly at the onset of gastrulation. Transcription, however, was not detected in the involuted cells, which form the mesodermal germlayer. At neurula stages Xclp2 mRNA was specifically found in the notochord, whereas Xclp3 was expressed in the neuroectoderm. Additionally the migrating cells of the embryonic heart and neural crest were positive for calponin expression. In summary the embryonic calponin pattern correlated with tissues in which cell movements occur.
Over- or misexpression experiments were performed to manipulate embryonic calponin function in Xenopus laevis. Gain of function experiments however did not interfere with embryonic development. Probably calponin function was posttranslational negatively regulated in these experiments.The overexpression of calponin proteins, in which specific phosphorylation sites were mutated or known regulatory calponin domains deleted, again didn´t result in altered phenotypes. However, the misexpression of calponin actin binding domaine 2 (ABD2) inhibited the migration of Krox 20 positive neural crest cells, suggesting that in this tissue the Xclp ABD2 acts dominant negative.
The presented data are not able to proof or disproof the hypothesis, that calponin proteins are effectors of the non canonical Wnt pathways.
Abstract (German)
Die wesentlichen embryonalen Stadien der Wirbeltierentwicklung kennzeichnen sich durch kontrollierte Zellbewegungen. Dazu gehören die Wanderung der Herzvorläuferzellen, die Migration der Neuralleistenzellen (NLZ) nach dem Neuralrohrschluss und vor allem die Zellinterkalationsbewegungen der konvergenten Extension während der Gastrulation und der Neurulation. Mit deren Hilfe werden die Chorda dorsalis, das Neuralrohr und damit die anterio-posteriore Körperachse gebildet, was zur Verlängerung des Embryos führt. Die Inhibition der konvergenten Extensionsbewegungen führt zu schweren Achsen- und Neuralrohrschlussdefekten.
Die notwendigen morphologischen Veränderungen und die Migration der Zellen beruhen auf der Dynamik ihrer Zytoskelettkomponenten und bedürfen der exakten Regulation der Filamentpolymerisation beziehungsweise der Interaktionen durch Bindeproteine.
Bei der Regulation der konvergenten Extensionsbewegungen wird vor
allem den sekretierten Wachstumfaktoren der Wnt-Familie eine Rolle zugesprochen. Dabei handelt es sich um die Mitglieder des sogenannten planaren Wnt-Zellpolarisations- (PCP) und des Wnt /Ca2+ -Signalwegs. Deren Zielproteine, d.h. die mit dem Aktin-Zytoskelett direkt interagierenden Effektoren, sind bisher nur zum Teil bekannt.
In der vorliegenden Arbeit sollten in diesem Zusammenhang die Eigenschaften der Calponin-Proteine als mögliche Regulatoren des Aktin-Zytoskeletts während den Zellumordnungs- und Bewegungsabläufen der embryonalen Entwicklung von Xenopus laevis untersucht werden. Die Proteine der Calponinfamilie sind in der Lage die Aktin-Myosinkontraktion inhibierend zu beeinflussen. Linear an die Aktinfilamente angelagert stabilisieren diese Proteine zudem das Aktin-Zytoskelett und wirken der Aktindepolymerisation entgegen.
Durch in situ Detektion von in Xenopus laevis klonierten Xclp1, Xclp2 und Xclp3 wurden erste Erkenntnisse der transkriptionellen Aktivität während der embryonalen Entwicklung gewonnen. Tatsächlich werden die, für die Proteine kodierenden Gene, in den motilen Zellen während der Gastrulation, Neurulation, Herzvorläuferzellmigration und Neuralleistenzell (NLZ)-wanderung exprimiert, wie hier zum ersten mal beschrieben wurde.
Überexpressions- beziehungsweise Missexpressionsexperimente in
Xenopus laevis sollten der Analyse der embryonalen Proteinfunktion dienen. Das Ausbleiben einer phänotypischen Veränderung in diesen Experimenten, ließ auf eine negative Regulation durch posttranslationale Modifikation wie Phosphorylierung oder eine autoregulatorische Inhibition schließen. Daher wurden potentielle Regulationsdomänen mutiert und Deletionsmutanten der Calponin-Proteine erzeugt. Über- bzw. Missexpressionsexperimente der mutanten Calponin-Proteine resultierten überraschenderweise nicht in phänotypischen Veränderungen der Froschembryonen.
Dennoch konnte die Aktivität einer Calponin-Deletionsmutanten nachgewiesen werden. Die Überexpression der zweiten, für die Aktinfilamentstabilisierung verantwortlichen Aktinbindedomäne, führte zum Block von NLZ Migration.
Funktionelle Analysen deuteten auf eine starke negative Regulation der embryonalen Calponin-Aktivität, hervorgerufen durch noch unbekannte Signalwege. Die Expressionsanalyse zeigte jedoch, dass embryonale Gewebe, in denen die nichtkanonischen Wnt-Signalwege aktiv sind, Xclp2 und Xclp3 Transkription aufweisen. Damit stellen diese beiden Regulationsproteine der Aktindynamik potentiell neue Effektoren der nichtkanonischen Wnt-Signalwege während der Gastrulation und dem Neuralrohrschluss dar.
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Faculty
Faculty of Natural Sciences
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Institute for Zoology
Examination date
2009-01-07
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Language
German
Publisher
Publisher place
Classification (DDC)
590 Animals (Zoology)
Collections
Original object
BibTeX
@phdthesis{Schmalholz2008,
url = {https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/5228},
author = {Schmalholz, Silke},
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