The role of serotonin and gap junctions in left-right development of Xenopus laevis

Abstract

In vertebrates, the correct determination of the left-right (LR) axis is essential for accurate placement of the inner organs, such that the heart points to the left, lung lobation differs between left and right side, spleen and stomach are located on the left,liver on the right body side and the gut coils asymmetrically. Disturbance of this organization can lead to severe impairments of organ function. In the African clawed frog Xenopus laevis, already in four-day old tadpoles asymmetric organ arrangement is visible. This coordinated organ development strictly requires prior Nodal cascade activity in the left lateral plate mesoderm (LPM) in all model organisms examined so far. The initial symmetry breaking event necessary for unilateral induction of Nodal signaling is still under debate. In X. laevis, two models, namely 'ion-flux' and 'cilia-driven leftward fluid flow', were discussed in this context. Leftward flow was first described in the mouse model and later on in fish and rabbit, whereas the 'ion-flux' hypothesis is supported by data derived from chick development. In the present work it was intended to enlighten this putative discrepancy by re-investigating the function of two 'ion-flux' components in context of leftward flow in the model organism X. laevis. First, a link between cell-cell communication via gap junctional communication (GJC)and LR axis establishment was analyzed by using heptanol for general inhibition of channel conductance on the one hand, and single knock-down (KD) of specific subunits on the other hand. Both treatments resulted in absence of the left-sided Nodal cascade. The KD led to shorter GRP cilia when compared to wildtype embryos and loss of bilateral Nodal expression at the GRP margin, respectively. Furthermore, heptanol treatments of stages in which the GRP already has been fully developed also resulted in laterality defects, thus implying a second function of GJC most likely for the signal transfer to the left side. These results indicated a role of GJC in leftward flow establishment and/or post-flow in neurula stages rather than a function in early cleavage stages for LR determination. Second, the early signaling function of the neurotransmitter serotonin (5-HT) was inhibited by over-expression of either a frog or a human receptor ligand binding domain(LBD). In addition, specific KD of a receptor class 3 subunit was performed. Both applications resulted in impaired left-sided marker gene expression and disturbed GRP morphogenesis. Remarkably, marker gene expression of the superficial mesoderm(SM) which gives rise to the GRP during development, was reduced in 5-HT signaling impaired embryos. Very importantly, receptor 3 specific 5-HT signaling was shown to represent a necessary competence factor required for Wnt-dependent axis development in the frog double axis induction assay. Besides the new function of 5-HT during early development, it was further shown that the expression of the SM marker Foxj1 (a master regulator of motile cilia) depended on maternal factors. Based on the work presented here, the following model is proposed: (1) Foxj1 expression is induced maternally, followed by (2) zygotic refinement in post-MBT stages, i.e. inhibition on the ventral and maintenance on the dorsal side. In the organizer region, an interplay of Wnt and 5-HT signaling is required for dorsal development.(3) Cilia driven leftward flow initiate an unknown downstream signal which is transferred to the left LPM. Both events, leftward flow and transfer, require active GJC. (4) A to date unknown signal gets transferred towards the left LPM in a GJC-dependent process and induces the Nodal cascade activity, a prerequisite for proper organ arrangement. Taken together, the data presented in this study indicate that the directed fluid flow in neurula embryos represent the decisive step for symmetry breakage with the 'ion-flux' components being involved in correct flow function.

Die Festlegung der links-rechts (LR) Achse ist essentiell für die korrekte Positionierung der inneren Organe. Beispielsweise ist das Herz zur linken Seite hin ausgerichtet und die Anzahl der Lungenloben unterscheidet sich auf der linken und rechten Seite. Die Milz und der Magen befinden sich auf der linken, die Leber auf der rechten Körperseite und der Darm weist eine asymmetrische Windung auf. Eine Beeinträchtigung dieser Ordnung kann zu schweren Funktionsstörungen dieser Organe führen. In allen bisher untersuchten Modellorganismen hängt die asymmetrische Positionierung der inneren Organe von der vorangegangenen Aktivität der Nodal-Kaskade im linken Seitenplattenmesoderm ab. Der initiale Mechanismus für den Symmetriebruch des zuerst bilateral organisierten Embryos ist jedoch bisher noch nicht vollständig geklärt. Die zwei Modelle, das "Ionenfluss"-Modell und die Hypothese des linksgerichteten Flüssigkeitsstromes, welche in dieser Dissertation diskutiert werden, sind beide in X. laevis beschrieben. Der durch Cilien getriebene gerichtete Flüssigkeitsstrom wurde erstmals für Maus und später auch für Fisch und Kaninchen experimentell nachgewiesen. Das Modell des "Ionenflusses" wird durch Daten gestützt, die im Huhn gewonnen wurden. Um diese vermeintlich kontroverse Datenlage zu klären wurden zwei Faktoren, welche dem "Ionenfluss" zugeordnet sind, hier neu aufgegriffen und auf einen möglichen Zusammenhang mit dem linksgerichteten Flussigkeitsstromes über der cilierten Struktur der Dachplatte des Gastrocoels (gastrocoel roof plate, GRP) in X. laevis hin analysiert. Als erstes wurde eine mögliche Funktion der durch Gap junctions (GJ) vermittelten Kommunikation der Zellen für die Entwicklung der LR-Achse untersucht. Dafür wurde zum Einen der Kanal der GJ mittels Heptanol blockiert, zum Anderen wurde die Translation einzelner Untereinheiten (Connexine, Cx) inhibiert. Beide Behandlungen verhinderten eine Induktion der Nodal-Kaskade auf der linken Seite. Die Inhibition der Translation einer bestimmten Untereinheit, dem Cx26, führte zu, verglichen mit der wildtypischen Situation, kürzeren GRP-Cilien und zusätzlich zu einem Verlust der bilateralen Nodaldomane in der Randzone der GRP. Durch die Blockierung der GJ-Kanale mittels Heptanol konnten jedoch auch Effekte beobachtet werden, wenn die Behandlung in älteren Stadien durchgeführt wurde, in welchen die GRP und die bilateral Nodal-Expression voll ausgebildet waren. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Zell-Zell Kommunikation über GJ neben der Rolle für die Morphogenese der GRP eine zweite Funktion für den Transfer eines Signals zur linken Seite haben konnte, welche möglicherweise dem Flüssigkeitsstrom nachgeschaltet ist. Als zweites wurde der Signalweg des Neurotransmitters Serotonin (5-HT) inhibiert, indem die Liganden-Bindedomäne einer Untereinheit des Rezeptors 3 überexprimiert wurde. Die Annahme war, dass dadurch 5-HT abgefangen wird, was zu einem Funktionsverlust des 5-HT Signalweges führen würde. Zum Vergleich wurde ein Funktionsverlust eben dieser Untereinheit mittels Inhibition der Translation durchgeführt. Beide experimentellen Ansätze führten zu einem Verlust der linksseitigen Expression von Markergenen und zu einer gestörten Entwicklung der GRP. Interessanterweise war auch die Markergen-Expression des Epithels (superficial mesoderm, SM) in Gastrula-Stadien gestört, welches die Struktur der GRP im Neurula-Stadien bildet. Zudem konnte gezeigt werden, dass der 5-HT-Signalweg für die Entwicklung der dorsalen Achse im Doppelachsen-Experiment notwendig war. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die Expression des Markers Foxj1 (ein Hauptregulator für die Entwicklung motiler Cilien) von maternalen Faktoren abhängt. Basierend auf den Daten, die in dieser Arbeit beschrieben wurden, wird das folgende Model vorgeschlagen: (1) Maternale Faktoren induzieren die Expression von Foxj1 im gesamten Mesoderm. (2) In Blastula-Stadien, in denen nun auch zygotische Gene aktiv sind, wird die Foxj1-Expressionsdomane durch ihre Inhibition auf der ventralen und Aufrechterhaltung auf der dorsalen Seite weiter spezifiziert. In der Region des Organisators sind der 5-HT und der Wnt-Signalweg notwendig für die Foxj1-Domane in Gastrula-Stadien. (3) In Neurula-Stadien sind die Cilien der GRP posterior lokalisiert und bewegen sich im Uhrzeigersinn wodurch ein nach links gerichteter Flüssigkeitsstrom generiert wird. An diesem Prozess sind GJ entscheidend beteiligt. (4) Ein bisher unbekanntes Signal wird, in Abhängigkeit von GJ, zur linken Seite transportiert wodurch die linksseitige Nodal-Kaskade induziert wird. Diese ist für die asymmetrische Position der Organe notwendig. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die durch Cilien generierte extrazelluläre Flüssigkeitsbewegung den eigentlichen Symmetriebruch darstellt und die Faktoren des "Ionenflusses" für die Entwicklung und Funktion eben dieser cilierten Struktur notwendig sind.