Untersuchung der lichtabhängigen Phosphorylierung des TRP-Kanals von Drosophila melanogaster

Abstract

The phototransduction cascade in the eye of Drosophila melanogaster culminates in the opening of the ion channels TRP and TRPL. The hereby increased intracellular concentration of sodium and calcium ions underlies the formation of the photoreceptor potential. The TRP channel is subject to light-dependent phosphorylation. 15 of its phosphorylation sites exhibit increased phosphorylation upon illumination and one phosphorylation site exhibits increased phosphorylation in the dark. When this work was started, neither the function of light-dependent TRP phosphorylation nor the involved kinases and phosphatases were known. Therefore, in the present work, kinases and phosphatases that affect the phosphorylation pattern of the TRP channel were identified. Towards this end a candidate screen of 79 kinase and phosphatase mutants was performed using three different phosphospecific antibodies. In this screen, eight kinases and one phosphatase were identified that affect the phosphorylation of one or more of the three tested phosphorylation sites. Eye-specific protein kinase C (ePKC) and protein kinase C 53E (PKC53E) mutants exhibited reduced phosphorylation at T849 of the TRP channel, while mutants of the Rolled kinase and the alpha-subunit of AMP-dependent kinase showed an increased phosphorylation at this site. The mutants of Casein kinase Ialpha, Licorne, Tao, and Metallophosphoesterase (MPPE) exhibited reduced phosphorylation of the site T864. The retinal degeneration C (RDGC) phosphatase null mutant demonstrated a dramatically increased phosphorylation at the phosphorylation site S936. From these identified kinase and phosphatase mutants, only the mutants of the kinase ePKC and of the phosphatase RDGC displayed physiological abnormalities in terms of an already described slow deactivation of the light response in ERG measurements. To answer the question whether the altered phosphorylation of the TRP ion channel in the ePKC and RDGC mutants underlies the prolonged deactivation of the light response, transgenic flies were generated that express modified TRP channels. To this end, the ePKC-dependent TRP phosphorylation site T849 or the RDGC-dependent phosphorylation site S936 of the TRP channel were replaced by the amino acid alanine or aspartic acid. The biochemical analysis of these four transgenic flies revealed wild type characteristics of the modified channels with respect to subcellular localization, the interaction with the scaffold protein INAD, multimerization, and the expression rate. However, electrophysiological studies of these transgenic flies revealed a prolonged deactivation time when T849 was exchanged to alanine and in addition S936 was exchanged to aspartic acid. Whereas the exchange of a serine or threonine to alanine prevents phosphorylation, the exchange to aspartic acid typically mimics phosphorylation of this site. In the wild type situation, T849 is phosphorylated in the light and becomes dephosphorylated in the dark whereas for S936 the exact opposite is the case. The amino acid exchanges at the two phosphorylation sites thus mimic the phosphorylation pattern of dark-adapted wild type flies. In summary, the results demonstrate the involvement of eight kinases and one phosphatase in generating of the phosphorylation pattern of the TRP ion channel. Two of the phosphorylation sites of the TRP ion channel mediate a rapid deactivation of the light response.

Die Phototransduktionskaskade im Auge von Drosophila melanogaster mündet in der Öffnung der beiden Ionenkanäle TRP und TRPL. Der hierdurch hervorgerufene intrazelluläre Anstieg der Natrium- und Calciumionenkonzentration führt zur Ausbildung des Photorezeptorpotentials. Der TRP-Kanal unterliegt dabei einer lichtabhängigen Phosphorylierung, wobei 15 seiner Phosphorylierungsstellen eine verstärkte Phosphorylierung im Licht zeigen und eine Phosphorylierungsstelle eine verstärkte Phosphorylierung im Dunkeln aufweist. Zu Beginn dieser Arbeit waren weder die Funktion der lichtabhängigen TRP-Phosphorylierung, noch die an ihr beteiligten Kinasen und Phosphatasen bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb nach Kinasen und Phosphatasen gesucht, die das Phosphorylierungsmuster des TRP-Kanals beeinflussen. Hierzu wurde ein Kandidaten-Screen mit 79 Kinase- und Phosphatasemutanten durchgeführt unter Verwendung von drei phosphospezifischen Antikörpern. In dem Screen wurden acht Kinasen und eine Phosphatase identifiziert, die die Phosphorylierung einer oder mehrerer der drei untersuchten Phosphorylierungsstellen beeinflussen. So zeigten die Mutanten der augenspezifischen Proteinkinase C (ePKC) und der Proteinkinase C 53E (PKC53E) eine verringerte Phosphorylierung an der Stelle T849 des TRP-Kanals, während die Mutanten der Kinase Rolled und der alpha-Untereinheit der AMP-abhängigen Kinase eine erhöhte Phosphorylierung an dieser Stelle zeigten. Die Mutanten der Caseinkinase Ialpha, Licorne, Tao und Metallophosphoesterase (MPPE) zeigten hingegen an der Phosphorylierungsstelle T864 eine verringerte Phosphorylierung. Die Nullmutante der Phosphatase Retinal Degeneration C (RDGC) zeigte eine drastisch verstärkte Phosphorylierung an der Phosphorylierungsstelle S936. Von den identifizierten Kinase- und Phosphatasemutanten wiesen nur die Mutanten der Kinase ePKC und der Phosphatase RDGC bei ERG-Messungen Auffälligkeiten in Form einer bereits beschriebenen langsamen Deaktivierung der Lichtantwort auf. Zur Klärung der Frage, ob die veränderte Phosphorylierung des TRP-Kanals in den Mutanten der ePKC beziehungsweise der RDGC der Grund für die verlängerte Deaktivierung der Lichtantwort ist, wurden transgene Fliegen hergestellt, die modifizierte TRP-Kanäle exprimieren. Hierzu wurden die ePKC-abhängige Phosphorylierungsstelle T849 oder die RDGC-abhängige Phosphorylierungsstelle S936 des TRP-Kanals durch die Aminosäure Alanin oder Asparaginsäure ersetzt. Die biochemische Analyse dieser vier transgenen Fliegen offenbarte wildtypische Eigenschaften der modifizierten Kanäle in Bezug auf die subzelluläre Lokalisation, die Interaktion mit dem Gerüstprotein INAD, die Multimerisierung und die Expressionsrate. Elektrophysiologische Untersuchungen dieser transgenen Fliegen zeigten hingegen eine Verlängerung der Deaktivierungszeit im ERG sowohl durch den Austausch von T849 zu Alanin als auch durch den Austausch von S936 zu Asparaginsäure. Während der Austausch von Serin oder Threonin zu Alanin eine Phosphorylierung verhindert, wirkt der Austausch zu Asparaginsäure in der Regel phosphomimetisch. In der Wildtypsituation liegt T849 im Licht phosphoryliert und im Dunkeln dephosphoryliert vor, während bei S936 genau das Gegenteil der Fall ist. Die Aminosäureaustausche an den beiden Phosphorylierungsstellen ahmen also den Phosphorylierungszustand in dunkeladaptierten Wildtyp-Fliegen nach. Zusammenfassend demonstrieren die Ergebnisse die Beteiligung von acht Kinasen und einer Phosphatase an der Einstellung des Phosphorylierungszustands des TRP-Kanals. Zwei der Phosphorylierungsstellen des TRP-Kanals vermitteln die schnelle Deaktivierung der Lichtantwort.