Role of reactive oxygen species in anti-cancer treatment: Investigations in 2-methoxyestradiol chemotherapy and 5-aminolevulinic acid based photodynamic therapy combined with hyperthermia

Abstract

The thesis deals with two different ROS-generating anti-cancer treatments: chemotherapy with the endogenous estrogen metabolite 2-methoxyestradiol and 5-aminolevulinic acid based photodynamic therapy. Both treatments were investigated with the rat DS-sarcoma model, which can be used in vitro and in vivo.

It the first part, it could be shown that 2-methoxyestradiol induces apoptosis in DS-sarcoma cells. Translocation of the pro-apoptotic protein Bax to the mitochondria was identified as initial apoptotic event, followed by a decrease in mitochondrial transmembrane potential and the release of AIF out of the mitochondria. In addition, upregulation of FasL and TNFalpha by 2-ME, two death receptor ligands, was observed. Although, 2-ME administration resulted in activation of caspases, pan caspase inhibitor Z-VAD-FMK could not block 2-ME induced apoptotic cell death pointing to a caspase-independent mechanism. Furthermore, an increase in formation of reactive oxygen species was observed after 2-ME treatment. However, supplementation with different antioxidants could not decrease the toxic effect of 2-ME. This finding may indicate, that reactive oxygen species are not involved in apoptosis induction, rather they are a consequence of mitochondrial damage. In vitro and in vivo combination of 2-ME with another ROS-generating treatment resulted in a synergistic anti-tumour effect.

In the second part of the thesis anti-tumour effects of 5-aminolevulinic acid based photodynamic therapy combined with simultaneous hyperthermia was investigated. Analysis of apoptosis associated nuclear changes clearly demonstrated the high efficiency of this treatment regime. Formation of reactive compounds (e.g. ROS, nitrogen monoxide, peroxynitrite) which is mainly responsible for toxicity of PDT, could be assessed in the shape of massive protein nitrosylation in tumours treated with PDT alone or the combined treatment. Detection of decreased amounts of heat shock proteins (HSP70 and HO-1) which protect tumour cells against damaging influences, lowered glutathione levels and reduced MMP-activity indicate an increase in degradation of proteins. This phenomenon may be caused by excessive generation of ROS.

Taken together, the presented studies could demonstrate the high benefit of combining 2-ME resp. ALA-PDT with hyperthermia (or other ROS-generating therapies), which make them interesting candidates for future clinical applications.

Die Dissertation befasst sich mit zwei unterschiedliche ROS-generierenden Therapien zur Krebsbekämpfung: zum einen mit der Chemotherapie des endogenen Estrogenmetaboliten 2-Methoxyestradiol, sowie der Photodynamischen Therapie, die auf der Gabe von 5-Aminolaevulinsäure basiert. Beide Behandlungsformen wurden mit Hilfe des DS-Sarkom Modells der Ratte untersucht, das sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt werden kann.

Im ersten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, daß 2-ME Apoptose in DS-Sarkom Zellen induziert. Als initiales apoptotisches Ereignis wurde die Translokation des pro-apoptotischen Proteins Bax an das Mitochondrium nachgewiesen, gefolgt von einer Erniedrigung des mitochondrialen Transmembranpotentials und der Freisetzung von AIF aus dem Mitochondrium. Des weiteren wurde eine erhöhte Expression von FasL und TNFalpha, zwei ?death receptor? Liganden, nach 2-ME Gabe beobachtet. Obwohl nach 2-ME-Verabreichung eine Aktivierung von Caspasen gemessen wurde, konnte die Gabe des Pan-Caspase-Inhibitors Z-VAD-FMK den apoptotischen Zelltod nicht verhindern, was auf einen Caspase-unabhängigen Mechanismus schließen lässt. Außerdem wurde eine erhöhte Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies nach 2-ME Administration nachgewiesen, durch die Stimulierung mit verschiedenen Antioxidantien konnte jedoch die toxische Wirkung von 2-ME nicht gemindert werden. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, daß reaktive Sauerstoffspezies nicht an der Apoptoseinduktion beteiligt sind, sondern als Folge der mitochondrialen Schädigung auftreten. Die Kombination von 2-ME mit einer weiteren ROS-erzeugenden Therapie zeigte sowohl in vitro also auch in vivo eine synergistische Steigerung der antitumoralen Wirkung.

Im zweiten Teil wurde die Tumor-inhibierende Wirkung einer auf 5-Aminolaevulinsäure basierten Photodynamischen Therapie, welche mit Hyperthermie kombiniert wurde, untersucht. Dabei konnte durch Bestimmung von Apoptose-assoziierten Veränderungen des Zellkernes der hohe Wirkungsgrad dieser Behandlungsform gezeigt werden. Die Bildung von reaktiven Verbindungen (z.B. ROS, Stickstoffmonoxid, Peroxynitrit), die hauptsächlich für die PDT vermittelte Toxizität verantwortlich sind, konnten in Form von nitrosylierten Proteinen in Tumoren bestimmt werden, die mit PDT oder der Kombinationstherapie behandelt wurden. Der Nachweis eines verringerten Gehaltes an Hitzeschockproteinen (HSP70 und HO-1), die das Tumorgewebe vor schädigenden Einflüsssen schützen, sowie ein erniedrigter Glutathionspiegels und eine reduzierte MMP-Aktivität, deuten auf eine gesteigerte Inaktivierung und Degradation von Proteinen hin. Diese wird vermutlich durch die exzessive ROS-Bildung verursacht.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß beide Kombinationstherapien (2-ME + Hyperthermie und ALA-PDT + Hyperthermie) effektiv das Tumorwachstum gehemmt haben, was sie zu interessanten Kandidaten für eine zukünftige klinische Anwendung macht.